Индукция литической репликации профага для транскриптомного анализа

Аннотация

Источник: Кришнамурти Р., и др.Изучение влияния умеренных бактериофагов на их лизогены с помощью транскриптомики. J. Vis. Exp. (2024)

В этом видео демонстрируется индукция литической репликации профага, интегрированного в бактериальный геном, и фиксация изменений в экспрессии генов посредством отбора проб в определенные моменты времени для транскриптомного анализа.

Протокол

1 . Подготовка неиндуцированных и индуцированных культур лизогена для экстракции РНК (рибонуклеиновой кислоты)

1. Подготовьте свежую ночную культуру, инокулировав одну колонию лизогена в 5 mL LB, и инкубируйте при 37 °C с перемешиванием (180 rpm (оборотов в минуту)) в течение 18–24 ч.
2. Пересейте ночную культуру в 80 mL LB (лизогенного бульона) в соотношении 1:100 в восемь колб объемом 250 mL.
3. Маркируйте первую колбу как «неиндуцированная», а остальные как «индуцированные», указав временные точки сбора каждого образца (например, «индуцированные t = 0», «индуцированные t = 10 мин», «индуцированные t = 20 мин» и т. д.; (Рисунок 1).
4. После 90 мин инкубации, когда OD (оптическая плотность) 600 составит от 0,1 до 0,2 или в момент минимальной спонтанной индукции (см. раздел обсуждения), добавьте 4 µL 1% ледяной уксусной кислоты (v/v) в неиндуцированную колбу (Рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку индуцирующий агент в данной работе был приготовлен с использованием 1% ледяной уксусной кислоты в качестве растворителя, в качестве контрольного этапа было добавлено такое же количество только растворителя. В зависимости от приготовления различных индукторов могут быть рассмотрены альтернативные варианты контроля.
5. Перенесите 80 mL культуры из неиндуцированной колбы в 720 mL стерильного LB и немедленно добавьте стоп-раствор (ледяной 5% [v/v] фенол, pH 4,3, 95 % [v/v] этанол) в объеме, составляющем 20% от объема культуры (160 mL), и инкубируйте на льду минимум 30 мин, но не более 2 ч для стабилизации транскриптов РНК. Это неиндуцированный образец.
6. Индуцируйте оставшиеся культуры в семи колбах по 250 mL (Рисунок 1), используя FMIC (конечную минимальную ингибирующую концентрацию) подходящего индуцирующего агента (в данном случае 25 mg·mL−1 норфлоксацина, приготовленного в 1% ледяной уксусной кислоте [w/v], в конечной концентрации 1 µg·mL−1), тщательно перемешайте и инкубируйте при 37 °C с перемешиванием при 180 rpm в течение 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап переведет культуру лизогена в более скоординированное состояние литического репликации. Большинство клеток в культуре начнут подвергаться литическому производству инфекционных частиц фага.
7. Дайте клеткам восстановиться, добавив 80 mL культуры из индуцированной колбы в 720 mL стерильного LB, что эффективно разбавляет индуцирующий агент. Сбирайте бактериальные клетки из каждой колбы каждые 10 мин с момента 0 до 1 ч, добавляя стоп-раствор, как указано в пункте 1.5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стоп-раствор стабилизирует РНК на срок до 2 ч. Однако для повышения стабильности образцов выполняйте все последующие этапы при 4 °C.
8. Соберите осадок центрифугированием при 10,000 x g в течение 15 мин при 4 °C как можно скорее, не позднее чем через 2 ч после обработки, чтобы избежать деградации РНК.
9. Удалите супернатант и осторожно ресуспендируйте бактериальные осадки в остаточной жидкости с помощью регулируемого автоматического дозатора перед переносом каждого образца в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 mL.
10. Центрифугируйте микроцентрифужные пробирки на высокой скорости (13,000 x g) в микроцентрифуге при 4 °C в течение 1 мин и удалите остаточный супернатант.
11. Быстро заморозьте осадки, погрузив каждую герметично закрытую микроцентрифужную пробирку в жидкий азот. Это будет способствовать эффективному лизису клеток для экстракции РНК.
12. Добавьте TRIzol (1 mL) к каждому замороженному осадку и гомогенизируйте суспензию путем пипетирования (не используйте вортекс). Храните при −80 °C до начала экстракции РНК для всех образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе протокол можно приостановить.
13. Повторите шаги 1.1–1.13 с тремя биологическими повторами.

Результаты

Рисунок 1: Схема эксперимента по отбору проб из индуцированных и неиндуцированных культур для выделения РНК.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фаги LES	Индуцированы и очищены из LESB58 с помощью норфлоксацина.	Данное исследование
Бульон LB (Lysogeny Broth)	Merck	1.10285.500
Агар LB (Lysogeny Broth Agar)	Merck	1.10283.500
Агар-агар	Fisher	A/1080/53
Верхний агар (Top Agar)	0.4 g агар-агара + 2.5 g бульона LB на 100 mL воды; автоклавировать и использовать.	-
Рифампицин	Sigma (Стоковый раствор: 50 mg/mL в метаноле — тщательно перемешать, стерилизовать через фильтр 0.22 µm и хранить при -20 °C до использования)	R3501
Ледяная уксусная кислота	Fisher, 1% (v/v) в воде	10060000
Норфлоксацин	Sigma (Стоковый раствор: 25 mg/mL в 1% ледяной уксусной кислоте — тщательно перемешать, стерилизовать через фильтр 0.22 µm и хранить при -20 °C до использования; для избежания циклов замораживания-оттаивания хранить в виде небольших аликвот)	N9890
Фенол, насыщенный цитратным буфером pH 4.3	Sigma	P-4682
Этанол для молекулярной биологии	Fisher	16695992
TRIzol	Invitrogen	12044977
Хлороформ	Fisher	11398187
Изопропанол	Fisher	17150576
Вода, свободная от нуклеаз	Invitrogen	10526945