Сбор AAV (аденоассоциированного вируса) и химический лизис трансфицированных клеток HEK293 (эмбриональных почек человека 293) Интенсивно встряхните камеру с клеточной культурой, чтобы отделить клетки, до тех пор, пока среда не станет мутной от отделяющихся клеток, и перелейте содержимое в четыре центрифужные пробирки объемом 500 мл. Центрифугируйте пробирки при 18 000 x g в течение 30 мин при 4 °C для осаждения клеток. Перелейте осветленный супернатант в бутылку из полиэтилентерефталат-гликоля (ПЭТГ) объемом 1 л. ПРИМЕЧАНИЕ: При отсутствии высокоскоростного центрифужника центрифугируйте при 12 000 x g в течение 40 мин. При такой скорости осадок клеток может быть неоднородным и смещаться при сливе супернатанта. Ресуспендируйте клеточные осадки в центрифужных пробирках объемом 500 мл в 50 мл лизирующего буфера и инкубируйте в течение 60 мин при 37 °C. Центрифугируйте пробирки при 18 000 x g в течение 30 мин, затем перенесите супернатант в ту же бутылку из ПЭТГ объемом 1 л. Осадок из клеточного дебриса удалите. ПРИМЕЧАНИЕ: Очистку осветленного супернатанта следует проводить немедленно; хранить при 4 °C не более 72 ч. Для длительного хранения используйте температуру -80 °C. Не хранить при -20 °C. Ргей, А. Д., и др.Производство векторов на основе аденоассоциированного вируса в клеточных стеках для доклинических исследований на моделях крупных животных. J. Vis. Exp. (2021)
В данном видео демонстрируется выделение сырого аденоассоциированного вируса из трансфицированных клеток млекопитающих с использованием химического лизиса и центрифугирования, что позволяет обеспечить высокий выход AAV для последующей очистки и применения в доклинических исследованиях по генной терапии.
