Очистка векторов на основе аденоассоциированного вируса методом аффинной хроматографии

Аннотация

Источник: Ргей, А. Д., и др.Производство векторов на основе аденоассоциированного вируса в многослойных клеточных культурах для доклинических исследований на моделях крупных животных. J. Vis. Exp. (2021)

В видео демонстрируется очистка векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (AAV) из сырого лизата клеток-хозяев с использованием аффинной матрицы на основе гепарина. Вирусные частицы связываются с иммобилизованным гепарином, в то время как примеси вымываются. Буфер с высокой концентрацией соли высвобождает интактные вирусы, которые собираются в обогащенных фракциях. Эти фракции концентрируют с помощью мембранного центрифугирования и промывают для восстановления остаточных частиц, что позволяет получить очищенные векторы AAV с высоким титром.

Протокол

1. Двойная трансфекция плазмидами клеток HEK293 в клеточных стеках

1. Разморозьте криопробирку с клетками эмбриональной почки человека 293 (HEK293) в водяной бане с шариками при температуре 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее подогрейте полную модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM) до 37 °C во время размораживания клеток, чтобы предотвратить холодовой шок при посеве. Убедитесь, что клетки имеют низкий номер пассажа, в идеале менее 20, для обеспечения оптимального роста и эффективности трансфекции. Убедитесь, что клетки сертифицированы как свободные от микоплазм.
2. Перенесите содержимое криопробирки по каплям в коническую пробирку объемом 15 mL, содержащую 10 mL подогретой полной DMEM, и центрифугируйте клетки при 500 × g в течение 5 min.
3. Аспирируйте среду, а затем ресуспендируйте клетки HEK293 в 20 mL подогретой полной DMEM. Посейте клетки в чашку диаметром 15 cm и инкубируйте при 37 °C в атмосфере 5% CO₂.
4. Разделите клетки из одной чашки 15 cm на три для посева в камеру для культивирования клеток.
   1. Когда клетки достигнут 80% конфлюэнтности, аспирируйте среду и осторожно промойте чашку 3 mL фосфатно-солевого буферного раствора (PBS), чтобы не нарушить монослой. Затем аспирируйте PBS и добавьте 3 mL трипсина.
   2. Инкубируйте в течение 2 min при 37 °C, пока клетки не открепятся от чашки, затем нейтрализуйте трипсин, добавив в чашку 7 mL полной DMEM.
   3. Соберите всю среду и клетки в пробирку объемом 15 mL и осадите клетки, центрифугируя при 500 × g в течение 5 min.
   4. Аспирируйте супернатант из пробирки 15 mL и ресуспендируйте клеточный осадок в 3 mL полной DMEM. Добавьте по 1 mL в каждую чашку 15 cm, содержащую 20 mL полной DMEM; осторожно покачайте чашки для равномерного распределения клеток и инкубируйте при 37 °C в атмосфере 5% CO₂.
5. Когда клетки достигнут 80% конфлюэнтности, повторите шаги 1.4.1 и 1.4.2. Соберите супернатант в конические пробирки объемом 50 mL и осторожно переверните пробирку, чтобы обеспечить гомогенность суспензии клеток.
6. Определите плотность клеток, смешав 10 µL образцов клеток с 10 µL трипанового синего, и нанесите смесь на предметное стекло для подсчета клеток с помощью автоматического счетчика клеток.
7. Смешайте 1 L подогретой полной DMEM с необходимым объемом суспензии клеток, чтобы заселить камеру для культивирования клеток (площадь поверхности 6360 cm²) с плотностью 1 × 10⁴ клеток/cm². Залейте клеточную смесь в камеру для культивирования клеток и осторожно вращайте ее для равномерного распределения клеток по каждому монослою (Рисунок 1), затем инкубируйте при 37 °C в атмосфере 5% CO₂.
8. Помимо камеры для культивирования клеток, посейте чашку 15 cm с плотностью 1 × 10⁴ клеток/cm² в качестве контроля конфлюэнтности.
9. После инкубации в течение ~65 ч проверьте контрольную чашку на конфлюэнтность — в идеале она должна составлять ~80%-90%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее подогрейте полную DMEM до 37 °C перед добавлением в камеру для культивирования клеток.
10. Приготовьте смесь полиэтиленимина (PEI)/ДНК с массовым соотношением 3:1 (w/w).
    1. Приготовьте смесь ДНК в конической пробирке объемом 50 mL, добавив 475 µg pTrangene и 1425 µg pHelper к 40 mL среды с пониженным содержанием сыворотки, чтобы создать соотношение pHelper:pTrangene 3:1.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Калькулятор смеси PEI/ДНК можно найти в Таблице 1.

Трансфекция камер клеточной культуры
Протокол
1. Перед началом трансфекции доведите ДНК, OptiMEM и ПЭИ до комнатной температуры.
2. Введите количество стеков клеток для трансфекции (дополнительный запас не требуется)
3. Убедитесь в правильности концентрации ДНК, так как от этого будут зависеть требуемые объемы
Количество камер для культивирования клеток		1
Концентрирование плазмиды с трансгеном		1	мг/мл
Концентрирование плазмиды pDGM6.2FF		1	мг/мл
		Количество на одну камеру для культивирования клеток		Основная смесь для трансфекции
	OptiMEM	48.1	мл	48.1	мл
Соотношение pTransgene:pHelper 1:3	pТрансген	475	µg	475	µL
	pHelper	1425	µg	1425	µL
4. Добавьте необходимые объемы OptiMEM и плазмидной ДНК в коническую пробирку объемом 50 мл
5. Переверните 10 раз для перемешивания
Соотношение ПЭИ:ДНК 3:1	PEI Max	5.7	мл	5.7	мл
6. Добавьте необходимое количество ПЭИ в пробирку объемом 50 мл, содержащую OptiMEM и плазмидную ДНК
7. Немедленно закройте пробирку объемом 50 мл, затем перемешайте содержимое, подвергнув его воздействию вортекса и перевернув пробирку 3–5 раз.
8. Установите таймер на 10 минут для инкубации комплексов PEI
9. Перенесите клеточные стеки, предназначенные для трансфекции, в шкаф биологической безопасности (ШББ)
10. Через 10 мин влейте смесь для трансфекции в один из оранжевых портов.
11. Осторожно перемешайте жидкость по всему объему клеточного стека
12. Верните стек с трансфицированными клетками в инкубатор, обеспечив одинаковый объем среды на каждом слое.
13. Соберите культуру клеток из камеры через 72 ч

Таблица 1: Калькулятор трансфекции для камеры клеточной культуры. Интерактивный рабочий лист для определения правильной концентрации pTransgene, pHelper и PEI для трансфекции камеры клеточной культуры.

2. По каплям добавьте 5,7 mL PEI (1 g/L) к среде с пониженным содержанием сыворотки и смеси ДНК. Затем коротко перемешайте на вортексе и инкубируйте в течение 10 min при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: При инкубации PEI/ДНК при комнатной температуре раствор станет слегка мутным.

11. По истечении 8 мин инкубации PEI/ДНК удалите среду из камеры для культивирования клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно ослабьте обе оранжевые крышки, чтобы обеспечить плавный ток среды и избежать отрыва клеток.
12. Добавьте PEI/ДНК в 1 L предварительно нагретой полной среды DMEM и медленно влейте смесь в порт камеры для культивирования клеток. Равномерно распределите жидкость по всем рядам (Рисунок 1) и инкубируйте в течение 72 h при 37 °C и 5% CO₂.

2 Сбор аденоассоциированного вируса (AAV) и химический лизис трансфицированных клеток HEK293

1. Интенсивно встряхните камеру с клеточной культурой, чтобы отделить клетки, до тех пор, пока среда не станет мутной от взвешенных клеток, и перелейте содержимое в четыре центрифужных пробирки объемом 500 mL.
2. Центрифугируйте пробирки при 18,000 × g в течение 30 min при 4 °C для осаждения клеток. Перелейте осветленный супернатант в бутыль объемом 1 L из полиэтилентерефталат-гликоля (PETG).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если высокоскоростная центрифуга недоступна, центрифугируйте при 12,000 × g в течение 40 min. При такой скорости осажденные клетки могут не образовать плотный осадок и будут смещаться при сливе супернатанта.
3. Ресуспендируйте клеточные осадки в центрифужных пробирках объемом 500 mL, добавив 50 mL лизирующего буфера, и инкубируйте в течение 60 min при 37 °C.
4. Центрифугируйте пробирки при 18,000 × g в течение 30 min, затем перенесите супернатант в ту же бутыль из PETG объемом 1 L. Удалите осажденный клеточный дебрис.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очищайте осветленный супернатант немедленно или храните при 4 °C не более 72 h. Для более длительного хранения используйте температуру -80 °C. Не хранить при -20 °C.

3 Очистка векторов AAV методом аффинной хроматографии на гепарине

1. Достаньте неочищенный лизат из морозильника (-80 °C) и оставьте при 4 °C на ночь для размораживания. После размораживания профильтруйте неочищенный лизат через фильтр 0,22 µM.
2. Для пассивации центрифужного концентратора добавьте 4 mL буфера для предварительной обработки фильтра в центрифужный концентратор для каждой используемой колонки с гепарин-сефарозой. Проведите пассивацию центрифужного концентратора при комнатной температуре в течение 2-8 h. Выполните пассивацию непосредственно перед этапами очистки.
3. Подготовьте трубки и насос (Рисунок 2).
   1. Поместите трубки в перистальтический насос и пропустите 20 mL 1 M NaOH. Затем пропустите 50 mL воды молекулярного качества, а после — 50 mL базовой среды DMEM.
   2. Подсоедините колонку с гепарин-сефарозой объемом 5 mL к трубкам и пропустите 25 mL базовой среды DMEM для удаления консерванта.
4. Пропустите 0,2 µM профильтрованного неочищенного лизата через колонку со скоростью потока 1-2 капли/s.

ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы в системе не образовывались пузырьки воздуха и колонка не пересыхала, так как это приведет к повреждению колонки и невозможности элюции AAV. Если колонка пересохла, ее следует утилизировать и использовать новую колонку для оставшейся части сырого лизата.

5. Нанесите весь неочищенный лизат на гепариновую колонку и используйте следующие растворы для промывки колонки.
   1. Промойте колонку, используя 50 mL 1× сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) без Mg²⁺ и Ca²⁺.
   2. Промойте колонку, используя 15 mL 0,5 % N-лауроилсаркозина в HBSS без Mg²⁺ и Ca²⁺.
   3. Промойте колонку, используя 50 mL HBSS без Mg²⁺ и Ca²⁺.
   4. Промойте колонку, используя 50 mL HBSS с Mg²⁺ и Ca²⁺
   5. Промойте колонку, используя 50 mL 200 mM NaCl/HBSS с Mg²⁺ и Ca²⁺.
   6. Элюируйте 5 × 5 mL (всего 25 mL) с помощью 300 mM NaCl/HBSS с Mg²⁺ и Ca²⁺ и обозначьте элюаты как E1-E5 (объем каждого элюата составляет 5 mL).
6. Концентрирование вируса с использованием центрифужного концентратора
   1. Центрифугируйте центрифужный концентратор, содержащий буфер для предварительной обработки, при 900 × g в течение 2 min. Слейте фильтрат.
   2. Промойте фильтр центрифужного концентратора 4 mL HBSS с Mg²⁺ и Ca²⁺ и центрифугируйте при 1000 × g в течение 2 min; слейте фильтрат.
   3. Добавьте элюат E2 в центрифужный концентратор. Центрифугируйте при 1000 × g в течение 5 min и слейте фильтрат.
   4. Добавьте оставшуюся часть E2, затем добавьте в центрифужный концентратор E3 и центрифугируйте при 1000 × g в течение 5 min, пока объем концентрированного вируса не составит примерно 1 mL.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте центрифугирования вектора до такого объема, который окажется ниже уровня фильтра. Не концентрируйте элюаты E1, E4 или E5 в центрифужном концентраторе, так как они содержат очень мало вектора или не содержат его вовсе, а также содержат примеси.
   5. Извлеките концентрированный вирус из центрифужного концентратора с помощью фильтрованного наконечника p200 и перенесите его в стерильную центрифужную пробирку объемом 1,5 mL.
   6. Промойте центрифужный концентратор 200 µL HBSS с Mg²⁺ и Ca²⁺, чтобы удалить с фильтра остатки AAV. Интенсивно пропипетируйте раствор вверх-вниз несколько раз (в течение ~30 s), чтобы отделить вирус, прилипший к мембране, и перенесите его в пробирку объемом 1,5 mL к остальной части вируса. Тщательно перемешайте содержимое пробирки.
   7. Отберите аликвоту 5 µL для экстракции ДНК и храните очищенный вектор при -80 °C.
7. Промойте колонку, используя 25 mL 2 M NaCl. Далее промойте колонку 25 mL 0,1% Triton X-100, предварительно нагретого до 37 °C. Затем промойте колонку 50 mL стерильной dH₂O, а затем 25 mL 20% этанола.
8. Убедитесь, что мембрана колонки полностью пропитана 20% этанолом, так как он является раствором для хранения. Герметично закройте колонку имеющимися пробками и храните при 4 °C.
9. Храните трубки в 1 M NaOH.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При правильной очистке колонки с гепарин-сефарозой можно использовать повторно до пяти раз.

Результаты

Рисунок 1: Манипуляции с клеточным стеком для посева клеток и трансфекции. Для посева клеток в клеточный стек начните с того, что снимите одну из вентиляционных крышек и влейте 1 L предварительно подогретой полной среды DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) с необходимым количеством клеток HEK293 (A). Равномерно распределите клетки и среду, закрутив обе вентиляционные крышки, слейте всю среду в один угол клеточного стека с помощью одной из вентиляционных крышек и наклоните стек в этот угол (B), положите клеточный стек на бок (C), а затем поверните его на 90° (D) так, чтобы вентиляционные отверстия были направлены вверх (E). Осторожно верните клеточный стек в обычное горизонтальное положение и убедитесь, что все камеры клеточного стека полностью покрыты средой (F). При трансфекции открутите обе вентиляционные крышки и медленно слейте старую среду в стерильный контейнер для отходов, обеспечивая равномерный поток, чтобы не повредить монослой клеток (G).

Рисунок 2: Схема установки перистальтического насоса для очистки аденоассоциированного вируса (AAV). Проложите трубку от сырого лизата через перистальтический насос в колонку с гепариновой матрицей.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фильтр 0.22 μm	Millipore Sigma	S2GPU05RE
0.25% Трипсин	Fisher Scientific	SM2001C
10-камерный Cellstack	Corning	3271
Бутыль из PETG 1L	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
Чашки для культивирования клеток	Greiner bio-one	7000232	пластины 15 cm
Коническая пробирка для культивирования	Thermo Fisher Scientific	339650	коническая пробирка 15 mL
Коническая пробирка для культивирования	Fisher Scientific	14955240	коническая пробирка 50 mL
Модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с 1000 mg/L D-глюкозы и L-глутамином	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Этанол	Greenfield	P016EA95	Развести этиловый спирт (95% об.) до 20% для раздела 3.7.4
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) с Mg²⁺ и Ca²⁺	Thermo Fisher Scientific	SH302268.02
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) без Mg²⁺ и Ca²⁺	Thermo Fisher Scientific	SH30588.02
Клетки HEK293	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	После получения разморозить клетки и культивировать согласно протоколу производителя. После минимального количества пассажей и достижения хорошего роста заморозить часть клеток в аликвотах для дальнейшего использования и хранить в жидком азоте. Всегда использовать клетки с номером пассажа не более 30. Если клетки были пассированы более 30 раз, рекомендуется начать культивирование заново из замороженных аликвот
Гепаринсульфатная колонка	Cytiva Life Sciences	17040703
Поддерживающая подушка для центрифужных пробирок большого объема	Corning	CLS431124	Поддерживающую подушку необходимо использовать с центрифужными пробирками большого объема, если ротор центрифуги не оснащен соответствующими V-образными подушками
Центрифужные пробирки большого объема	Corning	CLS431123-6EA	центрифужные пробирки 500 mL
Микроцентрифужная пробирка	Fisher Scientific	05-408-129	микроцентрифужная пробирка 1.5 mL, стерилизовать перед использованием
Вода молекулярного качества	Cytiva Life Sciences	SH30538.03
Натриевая соль N-лауроилсаркозина	Sigma Aldrich	L5125	ОСТОРОЖНО. Использовать перчатки
NaCl	Thermo Fisher Scientific	BP35810
Optimem, среда с пониженным содержанием сыворотки	Thermo Fisher Scientific	31985070
Пипетки Пастера	Fisher Scientific	13-678-20D	Стерилизовать перед использованием
Фосфатно-солевой буфер (10x)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Развести до 1x для использования с клетками
Раствор пенициллина-стрептомицина	Cytiva Life Sciences	SV30010
Плазмида pHelper	Дизайн de novo или получена из репозитория плазмид	NA
Стакан для пипеток	Thermo Fisher Scientific	13-681-502	Приобретать стерильные стаканы для пипеток
Полиэтиленгликоль трет-октилфениловый эфир (Triton X-100)	Thermo Fisher Scientific	9002-93-1	ОСТОРОЖНО. Использовать перчатки
Полиэтиленимин (PEI)	Polyscience	24765-1	Следуйте инструкциям производителя для приготовления 1L раствора. Профильтровать через фильтр 0.22 μm и хранить при 4°C
Плазмида pTrangene	Дизайн de novo или получена из репозитория плазмид	NA	Геном должен содержать SV40 polyA для совместимости с титрованием AAV в разделе 5.0
Трубки насоса	Cole-Parmer	RK-96440-14	Оптимизировать длину трубок и сбор вируса во фракциях E1-E5
Гидроксид натрия (NaOH)	Thermo Fisher Scientific	SS266-4
Трипановый синий	Bio-Rad	1450021