Очистка векторов на основе аденоассоциированного вируса методом аффинной хроматографии

Аннотация

Источник: Ргей, А. Д., и др.Производство векторов на основе аденоассоциированного вируса в многослойных клеточных культурах для доклинических исследований на моделях крупных животных. J. Vis. Exp. (2021)

В видео демонстрируется очистка векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (AAV) из сырого лизата клеток-хозяев с использованием аффинной матрицы на основе гепарина. Вирусные частицы связываются с иммобилизованным гепарином, в то время как примеси вымываются. Буфер с высокой концентрацией соли высвобождает интактные вирусы, которые собираются в обогащенных фракциях. Эти фракции концентрируют с помощью мембранного центрифугирования и промывают для восстановления остаточных частиц, что позволяет получить очищенные векторы AAV с высоким титром.

Протокол

1. Двойная трансфекция плазмидами клеток HEK293 в клеточных стеках

1. Разморозьте криопробирку с клетками эмбриональной почки человека 293 (HEK293) в водяной бане с шариками при температуре 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее подогрейте полную модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM) до 37 °C во время размораживания клеток, чтобы предотвратить холодовой шок при посеве. Убедитесь, что клетки имеют низкий номер пассажа, в идеале менее 20, для обеспечения оптимального роста и эффективности трансфекции. Убедитесь, что клетки сертифицированы как свободные от микоплазм.
2. Перенесите содержимое криопробирки по каплям в коническую пробирку объемом 1....

Результаты

Рисунок 1: Манипуляции с клеточным стеком для посева клеток и трансфекции. Для посева клеток в клеточный стек начните с того, что снимите одну из вентиляционных крышек и влейте 1 L предварительно подогретой полной среды DMEM (Dulbecco’s Modified Ea.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фильтр 0.22 μm	Millipore Sigma	S2GPU05RE
0.25% Трипсин	Fisher Scientific	SM2001C
10-камерный Cellstack	Corning	3271
Бутыль из PETG 1L	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
Чашки для культивирования клеток	Greiner bio-one	7000232	пластины 15 cm
Коническая пробирка для культивирования	Thermo Fisher Scientific	339650	коническая пробирка 15 mL
Коническая пробирка для культивирования	Fisher Scientific	14955240	коническая пробирка 50 mL
Модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с 1000 mg/L D-глюкозы и L-глутамином	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Этанол	Greenfield	P016EA95	Развести этиловый спирт (95% об.) до 20% для раздела 3.7.4
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) с Mg²⁺ и Ca²⁺	Thermo Fisher Scientific	SH302268.02
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) без Mg²⁺ и Ca²⁺	Thermo Fisher Scientific	SH30588.02
Клетки HEK293	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	После получения разморозить клетки и культивировать согласно протоколу производителя. После минимального количества пассажей и достижения хорошего роста заморозить часть клеток в аликвотах для дальнейшего использования и хранить в жидком азоте. Всегда использовать клетки с номером пассажа не более 30. Если клетки были пассированы более 30 раз, рекомендуется начать культивирование заново из замороженных аликвот
Гепаринсульфатная колонка	Cytiva Life Sciences	17040703
Поддерживающая подушка для центрифужных пробирок большого объема	Corning	CLS431124	Поддерживающую подушку необходимо использовать с центрифужными пробирками большого объема, если ротор центрифуги не оснащен соответствующими V-образными подушками
Центрифужные пробирки большого объема	Corning	CLS431123-6EA	центрифужные пробирки 500 mL
Микроцентрифужная пробирка	Fisher Scientific	05-408-129	микроцентрифужная пробирка 1.5 mL, стерилизовать перед использованием
Вода молекулярного качества	Cytiva Life Sciences	SH30538.03
Натриевая соль N-лауроилсаркозина	Sigma Aldrich	L5125	ОСТОРОЖНО. Использовать перчатки
NaCl	Thermo Fisher Scientific	BP35810
Optimem, среда с пониженным содержанием сыворотки	Thermo Fisher Scientific	31985070
Пипетки Пастера	Fisher Scientific	13-678-20D	Стерилизовать перед использованием
Фосфатно-солевой буфер (10x)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Развести до 1x для использования с клетками
Раствор пенициллина-стрептомицина	Cytiva Life Sciences	SV30010
Плазмида pHelper	Дизайн de novo или получена из репозитория плазмид	NA
Стакан для пипеток	Thermo Fisher Scientific	13-681-502	Приобретать стерильные стаканы для пипеток
Полиэтиленгликоль трет-октилфениловый эфир (Triton X-100)	Thermo Fisher Scientific	9002-93-1	ОСТОРОЖНО. Использовать перчатки
Полиэтиленимин (PEI)	Polyscience	24765-1	Следуйте инструкциям производителя для приготовления 1L раствора. Профильтровать через фильтр 0.22 μm и хранить при 4°C
Плазмида pTrangene	Дизайн de novo или получена из репозитория плазмид	NA	Геном должен содержать SV40 polyA для совместимости с титрованием AAV в разделе 5.0
Трубки насоса	Cole-Parmer	RK-96440-14	Оптимизировать длину трубок и сбор вируса во фракциях E1-E5
Гидроксид натрия (NaOH)	Thermo Fisher Scientific	SS266-4
Трипановый синий	Bio-Rad	1450021