Все процедуры с использованием образцов тканей животных были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этике работы с животными. Микроинъекция лентивирусных векторов в эмбрион на стадии одной клетки под блестящую оболочку (zona pellucida) ПРИМЕЧАНИЕ: Для микроинъекции используйте эмбрионы на стадии одной клетки с двумя видимыми пронуклеусами (Рисунок 1). Разморозьте аликвоту лентивируса (LV) при комнатной температуре и центрифугируйте при 10 0 x g и комнатной температуре (RT) в течение 2 минут, чтобы осадить оставшиеся клеточные остатки. Подготовка к микроинъекции Изготовьте стеклянные удерживающие пипетки (капилляры из боросиликатного стекла) с помощью микроформовочного устройства. Вытяните стеклянный капилляр над пламенем, чтобы получить кончик длиной 5–10 см. Обломайте пипетку, оставив кончик длиной около 4 см. Внешний диаметр должен составлять примерно 80–120 мкм. ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что кончик пипетки идеально прямой и гладкий. Установите вытянутую пипетку в микроформовочное устройство так, чтобы кончик находился перед нагревательной нитью. Разогрейте нить в непосредственной близости от кончика пипетки и дождитесь его сужения до диаметра около 15 мкм (примерно 20% от размера эмбриона). Расположите пипетку перпендикулярно нагревательной нити на расстоянии 2–3 мм от ее кончика и начните нагрев. Стекло размягчится. Нагревайте до достижения угла 15°. Подготовьте боросиликатные стеклянные капилляры для микроинъекций с помощью вытяжки для пипеток. Поместите капилляр в камеру вытяжки. Выполните тест на наклон (впервые для нового стекла и каждый раз после замены нити). Установите параметры: Heat (нагрев) — значение наклона минус 10, Pull (вытяжка) — 10, Velocity (скорость) — 150 и Time (время) — 100. ПРИМЕЧАНИЕ: Измените параметры для получения оптимального инъекционного капилляра. В ламинарном шкафу биологической безопасности с помощью наконечника микродозатора заберите примерно 2 мкл вирусного раствора в пипетку для микроинъекций. Подготовьте чашку для микроинъекций (крышку чашки Петри 60 мм) с каплей среды M2 объемом 10 мкл (по центру), покрытой жидким парафином или минеральным маслом. Закрепите удерживающую пипетку и капилляр для микроинъекций, заполненный вирусным раствором, в микроманипуляторе и установите над чашкой для микроинъекций под инвертированным микроскопом. Проведение микроинъекции Перенесите 15–20 эмбрионов на стадии одной клетки в каплю M2 в чашке для микроинъекций. Зафиксируйте эмбрион с помощью удерживающей пипетки. При 40-кратном увеличении введите раствор LV под блестящую оболочку в перивителлиновое пространство, используя стеклянный капилляр, подключенный к автоматическому инъектору. На мгновение придержите капилляр под блестящей оболочкой. ПРИМЕЧАНИЕ: При осторожном создании положительного давления вирусный раствор будет непрерывно вытекать из инъекционного капилляра, однако объем вводимой суспензии контролировать невозможно. С помощью тонкой пипетки верните эмбрионы в чашку для культивирования в инкубатор при 37 °C в атмосфере с 5% CO2. Количество инъекций в одну зиготу может варьироваться и может быть адаптировано в зависимости от концентрации вирусного вектора. ПРИМЕЧАНИЕ: Инъецированные эмбрионы можно перенести суррогатным матерям на стадии одной клетки или инкубировать в течение ночи в среде M16 перед переносом на стадии двух клеток. Следует избегать длительного культивирования эмбрионов крыс in vitro. Коза, П., и др. Создание трансгенных крыс с использованием лентивирусного векторного метода. J. Vis. Exp. (2020)
В данном видео демонстрируется доставка лентивирусных векторов в оплодотворенные эмбрионы крыс с помощью микроинъекций для обеспечения стабильной интеграции трансгена с целью создания трансгенных крыс.
