Очистка вирусной интегразы методом аффинной хроматографии

Аннотация

Никелевая аффинная хроматография Разморозьте один бактериальный осадок на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: этот процесс займет значительное время (приблизительно 2–3 ч). Когда осадок разморозится до состояния клеточной суспензии, добавьте дополнительные 500 мкМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) (из стокового раствора 100 мМ). Держите пробирку объемом 50 мл с бактериальной суспензией на льду. Соницируйте бактерии при амплитуде 30% в течение 30 с (1 с работа, 1 с отдых) на каждый осадок, полученный из 1 л культуры, используя соникатор с биозондом диаметром 0,5 дюйма и коническим микронаконечником диаметром 0,125 дюйма, частотой 20 кГц и максимальной мощностью 400 Вт. Перенесите образец клеток в холодную ультрацентрифужную пробирку. Используйте поликарбонатные флаконы (диаметром 25 мм, высотой 89 мм), совместимые с ротором с фиксированным углом типа 60 Ti. Допускается использование других пробирок и роторов при условии достижения той же центробежной силы. Центрифугируйте при 120 000 x g в течение 60 мин при 4 °C. Должен образоваться отчетливый осадок. Супернатант может иметь желтый цвет. Перенесите супернатант путем переливания или пипетирования в холодную коническую пробирку объемом 50 мл. Отметьте объем; этот объем должен быть примерно равен объему буфера для ресуспендирования, использованного перед мгновенным замораживанием. Если супернатант вязкий, он может быть загрязнен бактериальной ДНК, которая может забить хроматографическую колонку. В этом случае повторите ультрацентрифугирование для осаждения бактериальной ДНК. Приготовьте 500 мл буфера А (50 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 500 мМ NaCl, 500 мкМ PMSF) и 500 мл буфера Б (50 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 500 мМ NaCl, 500 мкМ PMSF, 200 мМ имидазола). ПРИМЕЧАНИЕ: в данном протоколе систему высокоэффективной жидкостной хроматографии (FPLC), все буферы и образец следует держать при 4 °C в холодильной комнате. Стерильно отфильтруйте буферы А и Б через одноразовые фильтры с порами 0,2 мкм. В зависимости от системы FPLC промойте насос А и насос Б буфером А и буфером Б соответственно. Пропустите через систему смесь из 90% буфера А и 10% буфера Б до стабилизации показателей электропроводности и ультрафиолетового (УФ) поглощения. Максимальная скорость потока зависит от прибора; используйте скорость потока 5 мл/мин с максимальным пределом давления 1,0 МПа. Подготовьте колонку FPLC длиной 110 мм и диаметром 5 мм с 1,5 мл никелевого сорбента (максимальная емкость связывания 50 мг/мл, максимальное давление 1 МПа). Колонку можно подготовить за день до очистки и хранить при 4 °C. Подключите колонку к прибору FPLC. Уравновесьте колонку 20 мл смеси 90% буфера А и 10% буфера Б (20 мМ имидазола) при скорости потока 0,5 мл/мин с максимальным пределом давления 0,5 МПа. Прибор должен регистрировать данные электропроводности и УФ-поглощения при 280 нм (A280) в режиме реального времени. Показатели электропроводности и УФ-поглощения должны стабилизироваться. Если показатели не стабилизировались, продолжайте пропускать буферы через колонку до достижения стабильности. Нанесите образец белка (~10 мл на один осадок) на колонку при скорости потока 0,15 мл/мин с максимальным пределом давления 0,5 МПа. Скорость потока и давление в колонке остаются неизменными на протяжении всей очистки. Соберите проскок в пробирку объемом 50 мл. Промойте колонку 20 мл смеси 90% буфера А и 10% буфера Б. Соберите промывочную жидкость в пробирку объемом 50 мл. Элюируйте белки линейным градиентом 20 мл от 10% до 100% буфера Б (от 20 мМ до 200 мМ имидазола). В завершение промойте колонку 5 мл 100% буфера Б (200 мМ имидазола). Соберите градиент и финальную промывку фракциями по 0,27 мл. Смешайте 15 мкл 2x буфера для образцов SDS-PAGE с 15 мкл фракций проскока, промывки и пиков A280. Прокипятите образцы в течение 3 мин. Приготовьте два 10% SDS-PAGE геля. Нанесите на гели по 10 мкл каждого образца и по 4 мкл предварительно окрашенных стандартов белка. Проведите электрофорез, окрасьте и проанализируйте гели. Объедините фракции, которые, исходя из визуального осмотра, содержат почти чистую интегразу прототипа пенистого вируса (PFV IN). Измерьте объем с помощью пипетки, обычно это 8–10 мл. С помощью спектрофотометра измерьте A280 объединенных фракций и рассчитайте общее количество белка PFV IN; типичный выход составляет ~10 мг на литр индуцированной культуры. Коэффициент экстинкции PFV IN с гексагистидиновым тегом составляет 59360 см⁻¹М⁻¹. Лопес-мл., М. А., и др.Обнаружение и удаление контаминации нуклеазами при очистке рекомбинантной интегразы прототипа пенистого вируса. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео демонстрируется очистка вирусной интегразы с полигистидиновым тегом с помощью никель-аффинной хроматографии. В данном протоколе используется элюция градиентом имидазола для селективного выделения интегразы на основе ее сродства к смоле с ионами никеля.

Протокол

1. Никель-аффинная хроматография

1. Разморозьте один бактериальный осадок на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс потребует значительного времени (примерно 2–3 ч). Когда осадок разморозится до состояния клеточной суспензии, добавьте дополнительно 500 μM фенилметилсульфонилфторида (PMSF) (сток-раствор 100 mM).
2. Держите пробирку объемом 50 mL с суспензией бактерий на льду. Сондируйте бактерии при амплитуде 30% в течение 30 с (1 с включено, 1 с выключено) на каждый осадок, полученный из 1 L культуры, используя соникатор с био-зондами диаметром 0,5 дюйма с коническим микронаконечником диаметром 0,125 дюйма, частотой 20 kHz и максимальной мощностью 400 W.
3. Перенесите образец клеток в охлажденную пробирку для ультрацентрифугирования. Используйте поликарбонатные флаконы (диаметром 25 mm, высотой 89 mm), совместимые с фиксированным угловым ротором типа 60 Ti. Можно использовать другие пробирки и роторы, если достигается та же центробежная сила. Центрифугируйте при 120,000 x g в течение 60 мин при 4 °C. Должен образоваться отчетливый осадок. Супернатант может иметь желтый цвет.
4. Перенесите супернатант путем переливания или пипетирования в охлажденную коническую пробирку объемом 50 mL. Отметьте объем; он должен быть примерно равен объему буфера для ресуспендирования, использованного перед мгновенным замораживанием. Если супернатант вязкий, он может быть загрязнен бактериальной ДНК, которая может забить хроматографическую колонку. В этом случае повторите ультрацентрифугирование для осаждения бактериальной ДНК.
5. Приготовьте 500 mL буфера А (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) и 500 mL буфера B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM имидазола).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе систему быстрой жидкостной хроматографии белков (FPLC), все буферы и образец следует поддерживать при 4 °C в холодном помещении.
   1. Пропустите буферы А и B через стерилизующие одноразовые фильтры с порами 0,2 μm. В зависимости от системы FPLC промойте насос А и насос B буфером А и буфером B соответственно. Прокачивайте через систему смесь 90% буфера А и 10% буфера B до стабилизации показателей электропроводности и ультрафиолетового (УФ) поглощения. Максимальная скорость потока зависит от прибора; используйте скорость потока 5 mL/min при максимальном пределе давления 1,0 MPa.
6. Подготовьте колонку FPLC длиной 110 mm и диаметром 5 mm с 1,5 mL смолы с иммобилизованным никелем (максимальная связывающая способность 50 mg/mL, максимальное давление 1 MPa). Колонку можно подготовить за день до очистки и хранить при 4 ˚C.
7. Подключите колонку к прибору FPLC. Уравновесьте колонку 20 mL смеси 90% буфера А и 10% буфера B (20 mM имидазола) при скорости потока 0,5 mL/min и максимальном пределе давления 0,5 MPa. Прибор должен регистрировать данные электропроводности и УФ-поглощения при 280 nm (A₂₈₀) в режиме реального времени. Показатели электропроводности и УФ-поглощения должны стабилизироваться. Если показатели не стабилизировались, продолжайте пропускать буферы через колонку до их стабилизации.
8. Нанесите образец белка (~10 mL на один осадок) на колонку при скорости потока 0,15 mL/min и максимальном пределе давления 0,5 MPa. Скорость потока и давление в колонке остаются неизменными на протяжении всей очистки. Соберите проскок в пробирку объемом 50 mL.
   1. Промойте колонку 20 mL смеси 90% буфера А и 10% буфера B. Соберите промывочную фракцию в пробирку объемом 50 mL. Элюируйте белки с помощью линейного градиента 20 mL от 10% до 100% буфера B (от 20 mM до 200 mM имидазола).
   2. В завершение промойте колонку 5 mL 100% буфера B (200 mM имидазола). Соберите градиент и финальную промывку фракциями по 0,27 mL.
9. Смешайте 15 μL 2-кратного буфера для образцов SDS-PAGE с 15 μL фракций проскока, промывки и пика A₂₈₀. Кипятите образцы в течение 3 мин.
   1. Приготовьте два 10% SDS-PAGE геля. Нанесите на гели по 10 μL каждого образца и по 4 μL предварительно окрашенных стандартов белка. Проведите электрофорез, окрасьте и проанализируйте гели.
   2. Объедините фракции, которые, по результатам визуального осмотра, содержат практически чистую интегразу прототипа пенистого вируса (PFV IN). Измерьте объем с помощью пипетки, обычно это 8–10 mL.
   3. С помощью спектрофотометра измерьте A₂₈₀ объединенных фракций и рассчитайте общее количество белка PFV IN; типичный выход составляет ~10 mg на литр индуцированной культуры. Коэффициент экстинкции PFV IN с гексагистидиновым тегом составляет 59360 cm^-1 M^-1.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
BL21/DE3 Rosetta E. coli	EMD Millipore	70956-4
Imidazole	Sigma-Aldrich	I0250
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430