Очистка вирусной интегразы методом аффинной хроматографии

Аннотация

Никель-аффинная хроматография Разморозьте один бактериальный осадок на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: этот процесс займет значительное время (приблизительно 2–3 ч). После того как осадок разморозится до состояния клеточной суспензии, добавьте дополнительно 50 мкМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) (из стокового раствора 10 мМ). Держите пробирку объемом 50 мл с бактериальной суспензией на льду. Проведите соникацию бактерий при амплитуде 30% в течение 30 с (1 с работа, 1 с отдых) на один осадок, полученный из 1 л культуры, используя соникатор с биозондом диаметром 0,5 дюйма и коническим микронаконечником диаметром 0,125 дюйма, при частоте 20 кГц и максимальной мощности 40 Вт. Перенесите образец клеток в охлажденную ультрацентрифужную пробирку. Используйте поликарбонатные флакон-системы (диаметром 25 мм, высотой 89 мм), совместимые с фиксированным угловым ротором типа 60 Ti. При достижении аналогичной центробежной силы допускается использование других пробирок и роторов. Центрифугируйте при 120 0 x g в течение 60 мин при 4 °C. Должен образоваться отчетливый осадок. Супернадант может иметь желтый цвет. Перенесите супернадант путем переливания или с помощью пипетки в охлажденную коническую пробирку объемом 50 мл. Отметьте объем; он должен быть примерно равен объему буфера для ресуспендирования, использованного перед мгновенным замораживанием. Если супернадант вязкий, он может быть загрязнен бактериальной ДНК, которая способна забить хроматографическую колонку. В этом случае повторите ультрацентрифугирование для осаждения бактериальной ДНК. Приготовьте 50 мл буфера А (50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 50 мМ NaCl, 50 мкМ PMSF) и 50 мл буфера B (50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 500 мМ NaCl, 500 мкМ PMSF, 20 мМ имидазола). ПРИМЕЧАНИЕ: в данном протоколе систему высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), все буферы и образец следует выдерживать при 4 °C в холодном помещении. Стерилизуйте буферы А и B, профильтруйте их через одноразовые фильтры с порами 0,2 мкм. В зависимости от системы ВЭЖХ промойте насос А и насос B буфером А и буфером B соответственно. Пропустите через систему смесь 90% буфера А и 10% буфера B до стабилизации показателей электропроводности и ультрафиолетового (УФ) поглощения. Максимальная скорость потока зависит от прибора; используйте скорость 5 мл/мин при максимальном пределе давления 1,0 МПа. Подготовьте колонку для ВЭЖХ длиной 10 мм и диаметром 5 мм с 1,5 мл сорбента с ионами никеля (максимальная емкость связывания 50 мг/мл, максимальное давление 1 МПа). Колонку можно подготовить за день до очистки и хранить при 4 °C. Подключите колонку к прибору ВЭЖХ. Уравновесьте колонку, пропустив 20 мл смеси 90% буфера А и 10% буфера B (20 мМ имидазола) при скорости потока 0,5 мл/мин и максимальном пределе давления 0,5 МПа. Прибор должен регистрировать данные электропроводности и УФ-поглощения при 280 нм (A280) в режиме реального времени. Показатели электропроводности и УФ-поглощения должны стабилизироваться. Если показатели не стабилизировались, продолжайте пропускать буферы через колонку до достижения стабильности. Нанесите образец белка (~10 мл на один осадок) на колонку при скорости потока 0,15 мл/мин и максимальном пределе давления 0,5 МПа. Скорость потока и давление в колонке остаются неизменными на протяжении всего процесса очистки. Соберите проскок в пробирку объемом 50 мл. Промойте колонку 20 мл смеси 90% буфера А и 10% буфера B. Соберите промывочную фракцию в пробирку объемом 50 мл. Элюируйте белки с помощью 20-мл линейного градиента от 10% до 10% буфера B (от 20 мМ до 20 мМ имидазола). В завершение промойте колонку 5 мл 10% буфера B (20 мМ имидазола). Соберите градиент и финальную промывку фракциями по 0,27 мл. Смешайте 15 мкл 2x буфера для образцов SDS-PAGE с 15 мкл проскока, промывочных фракций и фракций пика A280. Прокипятите образцы в течение 3 мин. Приготовьте два 10% SDS-PAGE геля. Нанесите на гели по 10 мкл каждого образца и 4 мкл предварительно окрашенных стандартов белка. Проведите электрофорез, окрашивание и анализ гелей. Объедините фракции, которые при визуальном осмотре кажутся почти чистой интегразой прототипа пенистого вируса (PFV IN). Измерьте объем с помощью пипетки, обычно это 8–10 мл. С помощью спектрофотометра измерьте A280 объединенных фракций и рассчитайте общее количество белка PFV IN; типичный выход составляет ~10 мг на литр индуцированной культуры. Коэффициент экстинкции PFV IN с гексагистидиновой меткой составляет 59360 см⁻¹М⁻¹. Лопес-мл., М. А., и др.Обнаружение и удаление контаминации нуклеазами при очистке рекомбинантной интегразы прототипного пенистого вируса. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео демонстрируется очистка вирусной интегразы с полигистидиновой меткой с помощью никель-аффинной хроматографии. В данном протоколе используется элюция градиентом имидазола для селективного выделения интегразы на основе ее сродства к никель-заряженной смоле.

Протокол

1. Никелевая аффинная хроматография

1. Разморозьте один бактериальный осадок на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс займет значительное время (приблизительно 2–3 ч). Когда осадок разморозится до состояния клеточной суспензии, добавьте дополнительно 50 μM фенилметилсульфонилфторида (PMSF) (стоковый раствор 10 mM).
2. Держите пробирку объемом 50 mL с бактериальной суспензией на льду. Соницируйте бактерии с амплитудой 30% в течение 30 с (1 с включено, 1 с выключено) на каждый осадок, полученный из 1 L культуры, используя соникатор с био-насадкой диаметром 0,5 дюйма с коническим микронаконечником диаметром 0,125 дюйма, частотой 20 kHz и максимальной мощностью 40 W.
3. Перенесите образец клеток в холодную пробирку для ультрацентрифугирования. Используйте поликарбонатные флаконы (диаметр 25 mm, высота 89 mm), совместимые с фиксированным угловым ротором типа 60 Ti. Допускается использование других пробирок и роторов при условии достижения такой же центробежной силы. Центрифугируйте при 120,00 x g в течение 60 мин при 4 °C. Должен образоваться отчетливый осадок. Супернатант может иметь желтый цвет.
4. Перенесите супернатант путем переливания или пипетирования в холодную коническую пробирку объемом 50 mL. Отметьте объем; этот объем должен быть примерно равен объему буфера для ресуспендирования, использованного перед мгновенной заморозкой. Если супернатант вязкий, он может быть загрязнен бактериальной ДНК, которая может забить хроматографическую колонку. В этом случае повторите ультрацентрифугирование для осаждения бактериальной ДНК.
5. Приготовьте 50 mL буфера А (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 μM PMSF) и 50 mL буфера B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 μM PMSF, 20 mM имидазола).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе систему высокоэффективной жидкостной хроматографии белков (FPLC), все буферы и образец следует выдерживать при 4 °C в холодном помещении.
   1. Стерилизуйте буферы А и B с помощью одноразовых фильтрующих элементов 0,2 μm. В зависимости от системы FPLC промойте насос А и насос B буфером А и буфером B соответственно. Пропустите через систему смесь 90% буфера А и 10% буфера B до стабилизации показателей электропроводности и ультрафиолетового (УФ) поглощения. Максимальная скорость потока зависит от прибора; используйте скорость потока 5 mL/min при максимальном пределе давления 1,0 MPa.
6. Подготовьте колонку FPLC длиной 10 mm и диаметром 5 mm с 1,5 mL смолы с закрепленным никелем (максимальная связывающая способность 50 mg/mL, максимальное давление 1 MPa). Колонку можно подготовить за день до очистки и хранить при 4 ˚C.
7. Подключите колонку к прибору FPLC. Уравновесьте колонку 20 mL смеси 90% буфера А и 10% буфера B (20 mM имидазола) при скорости потока 0,5 mL/min и максимальном пределе давления 0,5 MPa. Прибор должен регистрировать данные электропроводности и УФ-поглощения при 280 nm (A₂₈₀) в режиме реального времени. Показатели электропроводности и УФ-поглощения должны стабилизироваться. Если значения не стабилизировались, продолжайте пропускать буферы через колонку до достижения стабильности.
8. Нанесите образец белка (~10 mL на один осадок) на колонку при скорости потока 0,15 mL/min и максимальном пределе давления 0,5 MPa. Скорость потока и давление в колонке остаются неизменными на протяжении всего процесса очистки. Соберите проскок в пробирку объемом 50 mL.
   1. Промойте колонку 20 mL смеси 90% буфера А и 10% буфера B. Соберите промывочный раствор в пробирку объемом 50 mL. Элюируйте белки линейным градиентом 20 mL от 10% до 10% буфера B (от 20 mM до 20 mM имидазола).
   2. В завершение промойте колонку 5 mL 100% буфера B (200 mM имидазола). Соберите градиент и финальную промывку фракциями по 0,27 mL.
9. Смешайте 15 μL 2-кратного буфера для образцов SDS-PAGE с 15 μL фракций проскока, промывки и пиков A₂₈₀. Кипятите образцы в течение 3 мин.
   1. Приготовьте два 10% геля для SDS-PAGE. Нанесите на гели по 10 μL каждого образца и 4 μL предварительно окрашенных стандартов белков. Проведите электрофорез, окрашивание и анализ гелей.
   2. Объедините фракции, которые, по визуальному осмотру, содержат почти чистую интегразу прототипа пенистого вируса (PFV IN). Измерьте объем с помощью пипетирования, обычно это 8–10 mL.
   3. С помощью спектрофотометра измерьте A₂₈₀ объединенных фракций и рассчитайте общее количество белка PFV IN; типичный выход составляет ~10 mg на литр индуцированной культуры. Коэффициент экстинкции PFV IN с гексагистидиновым тегом составляет 59360 cm^-1 M^-1.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
BL21/DE3 Rosetta E. coli	EMD Millipore	70956-4
Imidazole	Sigma-Aldrich	I0250
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430