Очистка вирусной интегразы с помощью гепарин-аффинной хроматографии

Аннотация

Аффинная хроматография на гепарине. Приготовьте 250 мл буфера C (50 мМ гидрохлорида трис(гидроксиметил)аминометана (Tris-HCl), pH 7,5, 10 мМ дитиотреитола (DTT), 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), 500 мкМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF)) и 250 мл буфера D (50 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 10 мМ DTT, 0,1 мМ EDTA, 500 мкМ PMSF, 1 М NaCl). ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе система высокоэффективной жидкостной хроматографии белков (FPLC), буферы и образец выдерживаются в холодильной комнате при температуре 4 °C. Стерилизуйте буферы C и D с помощью одноразовых фильтрующих устройств с порами 0,2 мкм. В зависимости от системы FPLC промойте насос A и насос B буфером C и буфером D соответственно. Пропустите через систему смесь из 80% буфера C и 20% буфера D до стабилизации показателей электропроводности и ультрафиолетового (УФ) поглощения. Максимальная скорость потока зависит от прибора; обычно мы используем скорость потока 5 мл/мин с пределом максимального давления 1,0 МПа. Подготовьте колонку для FPLC длиной 80 мм и диаметром 5 мм с 1 мл сорбента heparin Sepharose (максимальная связывающая способность 2,0 мг бычьего антитромбина III на мл сорбента; максимальное давление 1,4 МПа). Колонку можно подготовить за день до очистки и хранить при 4 °C. Подключите колонку к прибору FPLC. Уравновесьте колонку 20 мл смеси 80% буфера C и 20% буфера D (200 мМ NaCl) при скорости потока 0,5 мл/мин и пределе максимального давления 1 МПа. Прибор должен регистрировать данные об электропроводности и УФ-поглощении при 280 нм (A280) в режиме реального времени. Показатели электропроводности и УФ-поглощения должны стабилизироваться. Если показатели не стабилизировались, продолжайте пропускать буферы через колонку до достижения стабильности. Снизьте концентрацию NaCl в образце интегразы прототипового пенистого вируса (PFV IN) до 200 мМ, добавив 1,5 объема буфера C. Например, добавьте 15 мл буфера C к 10 мл PFV IN. Наш общий объем обычно составляет ~25 мл. Нанесите разбавленный образец PFV IN на колонку heparin Sepharose при скорости потока 0,5 мл/мин и пределе максимального давления 1,0 МПа. Скорость потока и давление в колонке остаются неизменными на протяжении всей очистки. Соберите несвязавшуюся фракцию (проскок) в коническую пробирку объемом 50 мл. Промойте колонку 20 мл смеси 80% буфера C и 20% буфера D (200 мМ NaCl), собирая промывочный раствор в коническую пробирку объемом 50 мл. Элюируйте содержимое колонки с помощью линейного градиента объемом 30 мл от 20% до 100% буфера D (от 200 мМ до 1 М NaCl). Промойте колонку 5 мл 100% буфера D. Соберите градиент и финальную промывку фракциями по 0,37 мл. Проанализируйте нанесенный образец, проскок, промывочный раствор и фракции с помощью 8% электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE). PFV IN после отщепления гексагистидиновой метки имеет молекулярную массу 44 394 Да, а коэффициент экстинкции без гексагистидиновой метки составляет 59 360 см⁻¹ М⁻¹. Храните все фракции при 4 °C до завершения анализа нуклеазной активности. Лопес-мл., М. и др.Обнаружение и удаление контаминации нуклеазами при очистке рекомбинантной интегразы прототипа пенистого вируса. J. Vis. Exp. (2017)

В данном видео демонстрируется процедура очистки вирусной интегразы от бактериального нуклеазного загрязнения с помощью колоночной хроматографии на heparin Sepharose с последующим анализом методом SDS-PAGE для подтверждения чистоты белка.

Протокол

1. Гепарин-аффинная хроматография
   1. Приготовьте 250 mL буфера C (50 mM гидрохлорида трис(гидроксиметил)аминометана (Tris-HCl), pH 7,5, 10 mM дитиотреитола (DTT), 0,1 mM этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), 500 μM фенилметилсульфонилфторида (PMSF)) и 250 mL буфера D (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе система быстрой жидкостной хроматографии белков (FPLC), буферы и образец выдерживаются в холодильной комнате при 4 ˚C.
      1. Пропустите буферы C и D через стерилизующие одноразовые фильтры с порами 0,2 μm. В зависимости от системы FPLC промойте насос A и насос B буфером C и буфером D соответственно. Пропускайте через систему смесь 80% буфера C и 20% буфера D до стабилизации показателей электропроводности и ультрафиолетового (УФ) поглощения. Максимальная скорость потока зависит от прибора; обычно мы используем скорость потока 5 mL/min при максимальном пределе давления 1,0 MPa.
   2. Подготовьте колонку для FPLC длиной 80 mm и диаметром 5 mm, заполнив ее 1 mL сефарозы с гепарином (максимальная связывающая способность 2,0 mg бычьего антитромбина III на mL смолы; максимальное давление 1,4 MPa). Колонку можно подготовить за день до очистки и хранить при 4 °C. Подключите колонку к прибору FPLC.
      1. Уравновесьте колонку 20 mL смеси 80% буфера C и 20% буфера D (200 mM NaCl) при скорости потока 0,5 mL/min и максимальном пределе давления 1 MPa. Прибор должен регистрировать данные об электропроводности и УФ-поглощении при 280 nm (A₂₈₀) в режиме реального времени. Показатели электропроводности и УФ-поглощения должны стабилизироваться. Если показатели не стабилизировались, продолжайте пропускать буферы через колонку до достижения стабильных значений.
   3. Снизьте концентрацию NaCl в образце интегразы прототипа пенистого вируса (PFV IN) до 200 mM, добавив 1,5 объема буфера C. Например, добавьте 15 mL буфера C к 10 mL PFV IN. Общий объем обычно составляет ~25 mL.
   4. Нанесите разбавленный образец PFV IN на колонку с сефарозой с гепарином при скорости потока 0,5 mL/min и максимальном пределе давления 1,0 MPa. Скорость потока и давление в колонке остаются неизменными на протяжении всей очистки. Соберите несвязавшуюся фракцию (проскок) в коническую пробирку объемом 50 mL.
      1. Промойте колонку 20 mL смеси 80% буфера C и 20% буфера D (200 mM NaCl), собирая промывочную жидкость в коническую пробирку объемом 50 mL. Элюируйте колонку линейным градиентом от 20% до 100% буфера D (от 200 mM до 1 M NaCl) объемом 30 mL.
      2. Промойте колонку 5 mL 100% буфера D. Соберите градиент и финальную промывку фракциями по 0,37 mL.
   5. Проанализируйте нанесенный образец, проскок, промывку и фракции с помощью 8% электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE). PFV IN после отщепления гексагистидинового тега имеет молекулярную массу 44 394 Da, а коэффициент экстинкции без гексагистидинового тега составляет 59 360 cm^-1 M^-1. Храните все фракции при 4 ˚C до проведения анализа нуклеазной активности.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
IPTG (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид)	Denville Scientific	CI8280
Tris Ultra Pure	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
NaCl	P212121	RP-S23020
PMSF (фенилметилсульфонилфторид)	Amresco	754
DTT (дитиотреитол)	P212121	SV-DTT
UltraPure EDTA	Invitrogen/Gibco	15575
Heparin Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0998-01