Определение титра псевдовируса на основе вируса везикулярного стоматита, экспрессирующего спайк-белок коронавируса и усиленный зеленый флуоресцентный белок (VSV-S-eGFP) 1. Серийные разведения для определения титра вируса 1. Высейте клетки Vero E6 в 6-луночные планшеты с плотностью посева 6 × 10⁵ клеток на лунку в модифицированной среде Игла в модификации Дульбекко или DMEM (с добавлением 10% FBS (фетальной бычьей сыворотки)) и инкубируйте в течение ночи при 37 °C в атмосфере с 5% CO₂. ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно использовать клетки Vero с гиперэкспрессией TMPRSS2 и hACE2. 2. Подготовьте серию десятикратных серийных разведений вируса VSV-SeGFP в охлажденной среде DMEM без сыворотки, налив по 900 мкл среды в семь микроцентрифужных пробирок. Промаркируйте пробирки от 1 до 7. Добавьте 100 мкл стокового раствора вируса в первую пробирку и коротко перемешайте на вортексе. Перенесите 100 мкл разведенного вируса из пробирки 1 в пробирку 2 и коротко перемешайте на вортексе; повторите процедуру до пробирки 7. 3. Аспирируйте среду из всех лунок 6-луночного планшета с клетками Vero E6 и замените её 500 мкл разведений от 10⁵ до 10⁷. Инкубируйте планшеты в течение 45 мин при 37 °C с 5% CO₂, осторожно покачивая каждые 15 мин. 4. Аспирируйте инокулят и замените его накрывающим слоем, состоящим из смеси 2x DMEM и 6% карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) в соотношении 1:1 (конечная концентрация КМЦ 3%), с добавлением 10% FBS; инкубируйте при 34 °C с 5% CO₂ в течение 48 ч. ПРИМЕЧАНИЕ: На этапе инфицирования предварительно прогрейте смесь для накрывного слоя на водяной бане при 37 °C в течение 15 мин. Вместо КМЦ можно использовать смесь 1% агарозы с 2x DMEM с добавлением 10% FBS в соотношении 1:1. Для приготовления агарозного слоя прокипятите 1% агарозу (в dH₂O) и смешайте с холодным 2x DMEM. Перед нанесением на монослой клеток убедитесь, что смесь имеет подходящую температуру (примерно 37–40 °C). Если для накрывного слоя используется агароза, клетки необходимо зафиксировать, инкубируя в 2 мл смеси метанола и уксусной кислоты (3:1) в течение не менее одного часа перед окрашиванием. 2. Окрашивание и расчет титра вируса 1. Визуализируйте бляшки путем окрашивания кристаллическим фиолетовым или путем прямой визуализации eGFP с помощью флуоресцентного микроскопа. 2. Для окрашивания планшетов аспирируйте накрывный слой, один раз промойте PBS, затем добавьте в каждую лунку 2 мл 0,1% раствора кристаллического фиолетового (в 80% метаноле и dH₂O). Поместите планшет на шейкер примерно на 20 мин при комнатной температуре перед обесцвечиванием. Удалите кристаллический фиолетовый и осторожно промойте каждую лунку дважды, используя dH₂O или PBS. ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы промывки и окрашивания следует выполнять осторожно, медленно дозируя жидкость к стенке каждой лунки, чтобы монослой клеток оставался неповрежденным на протяжении всей процедуры. 3. Дайте планшетам высохнуть в течение не менее 1 ч перед подсчетом бляшек. Для подсчета выбирайте лунки, содержащие от 20 до 200 бляшек. Чтобы рассчитать титр вируса в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на мл, умножьте коэффициент разведения в подсчитанной лунке на объем инокулята и разделите полученное число на количество бляшек в соответствующей лунке. Джеймисон, Т. Р., и др., Определение нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 с помощью высокопроизводительной флуоресцентной визуализации инфекции псевдовирусом. J. Vis. Exp. (2021)
В данном видео описывается метод анализа бляшек вируса с использованием частиц псевдовируса коронавируса. Разведенный псевдовирус добавляют к монослою клеток млекопитающих, после чего следует инкубация с наложением слоя метилцеллюлозы. Бляшки, образованные инфицированными клетками, подсчитывают визуально для определения титра инфекционного вируса.
