Все процедуры по сбору образцов были выполнены в соответствии с рекомендациями институционального наблюдательного совета (IRB) института. Разведение антител или сыворотки и инфицирование ПРИМЕЧАНИЕ: Данный протокол может быть использован для измерения нейтрализации псевдовируса на основе вируса везикулярного стоматита, экспрессирующего спайковый белок коронавируса и усиленный зеленый флуоресцентный белок (VSV-S-eGFP), как коммерчески доступными антителами, так и сывороткой пациентов, а также сывороткой, полученной от животных в исследованиях по доклинической разработке вакцин. Серии последовательных разведений Перед разведением образцов сыворотки подвергните каждый образец термоинактивации на водяной бане при 56 °C в течение 30 мин для инактивации комплемента. Соблюдайте необходимые меры предосторожности при работе с образцами пациентов; открывайте контейнеры с образцами только в шкафу для культивирования тканей и используйте соответствующие средства индивидуальной защиты для 2-го уровня биологической безопасности. Подготовьте серию разведений в пустом 96-луночном планшете (Планшет 1). Начните все разведения в ряду А 96-луночного планшета, добавив 80 мкл. *Для образцов пациентов начните серию разведений с 1:10, поместив 8 мкл сыворотки в 72 мкл модифицированной среды Игла в модификации Дульбекко (DMEM) без сыворотки (с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина). ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация используемого нейтрализующего антитела будет зависеть от активности, указанной производителем. Для нейтрализующего антитела к спайковому белку SARS-CoV-2, использованного в данной работе (см. таблицу материалов), начните с 5 мкг/мл, чтобы наблюдать нейтрализацию не менее 50%. Добавьте 40 мкл DMEM без сыворотки (с 1% пенициллина/стрептомицина) в ряды с B по G и 80 мкл в ряд H. Не добавляйте вирус в ряд H, так как он служит контролем только с клетками. С помощью 12-канального многоканального дозатора перемешайте и перенесите 40 мкл разведенной сыворотки или антитела из ряда A в ряд B. Перемешайте и повторяйте процедуру до ряда F, затем удалите 40 мкл из ряда F. Не добавляйте сыворотку в ряд G, так как этот ряд является контролем только с вирусом. Инфицирование и наложение оверлея Подготовьте соответствующий объем разведенного VSV-S-eGFP для обработки каждой лунки с множественностью заражения (MOI) 0,05 (или 2000 бляшкообразующих единиц (БОЕ)). (При выполнении этого расчета имейте в виду, что на клетки будет перенесено только 60 мкл из общего объема 80 мкл; следовательно, обязательно умножьте объем вируса на 1,33 для поддержания 2000 БОЕ). ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку VSV-S-eGFP чувствителен к температуре, следите за тем, чтобы вирусные стоки находились на льду, когда они не используются, и избегайте многократных циклов замораживания-оттаивания, так как после повторных замораживаний титры изменятся. Добавьте 40 мкл разведенного вируса в каждую лунку рядов с A по G Планшета 1 и перемешайте, пропипетировав содержимое вверх-вниз 4–5 раз. Инкубируйте планшет в течение 1 ч при 37 °C и 5% CO2. Извлеките из инкубатора планшет с клетками (Планшет 2) и осторожно аспирируйте среду из всех лунок. Перенесите 60 мкл смеси антитела/вируса из Планшета 1 в Планшет 2 и инкубируйте в течение 1 ч при 37 °C и 5% CO2, покачивая планшет каждые 20 мин. Долейте в каждую лунку 140 мкл оверлея, содержащего карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ) в DMEM, до конечной концентрации 3% КМЦ (с 10% FBS (фетальной бычьей сыворотки) и 1% пенициллина/стрептомицина). Поместите Планшет 2 в инкубатор, настроенный на 34 °C и 5% CO2, примерно на 24 ч перед проведением визуализации. ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно прогрейте смесь оверлея на водяной бане при 37 °C в течение 15 мин во время этапа инфицирования. 2. Визуализация и количественный анализ (День 3) Проведите визуализацию планшетов с помощью автоматического флуоресцентного имиджера (используя фильтр для флуоресцеинизотицианата (FITC) или альтернативный фильтр с длиной волны возбуждения 488 нм). Количественно оцените вирусную инфекцию, создав протокол, который автоматически идентифицирует и подсчитывает отдельные фокусы eGFP (усиленного зеленого флуоресцентного белка). Если функция автоматического подсчета недоступна, используйте программное обеспечение ImageJ для подсчета количества фокусов eGFP. Джеймисон, Т. Р., и др. Обнаружение нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 с помощью высокопроизводительной флуоресцентной визуализации инфекции псевдовирусом. J. Vis. Exp. (2021)
В данном видео демонстрируется антитело-опосредованная нейтрализация псевдовирусов, несущих спайковые белки коронавируса, с использованием сыворотки пациентов; исследование проводится методом высокопроизводительной флуоресцентной визуализации инфицированных монослоев эпителиальных клеток.
