Мониторинг стадиеспецифической экспрессии генов вируса вакцинии с помощью флуоресцентных репортеров

Аннотация

1. Посев клеток Диссоциируйте клетки HeLa с планшета и разведите в ростовой среде (модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко [DMEM], 2 мМ L-глутамина, 10% эмбриональной бычьей сыворотки [FBS]) до концентрации приблизительно 2,0 x 10⁵ клеток/мл. Внесите по 100 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета с черными стенками и прозрачным плоским дном (20 000 клеток на лунку). Инкубируйте клетки в течение 24 часов до достижения конфлюэнтности в инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂. 2. Инфицирование клеток Разведите вирусы и инфицируйте клетки. Разморозьте флуоресцентные вирусы TrpV (тройной вирус: ранний Venus, промежуточный mCherry, поздний TagBFP) и PLV (Venus без промотора) и дезагрегируйте их с помощью соникации в течение 5 минут. В качестве альтернативы необработанные стоковые растворы вируса можно смешать в соотношении 1:1 с трипсином (0,25 мг/мл) в среде для инфицирования и инкубировать при 37 °C в течение 30 мин. Разведите необработанные стоковые растворы вируса в среде для инфицирования при 37 °C (DMEM, 2 мМ L-глутамина, 2% FBS). Для инфицирования с высокой множественностью заражения (MOI) (10 PFU/клетку) разведите вирусный сток до 1,0 x 10⁷ PFU/мл, исходя из 5 x 10⁴ клеток на лунку и объема инокулята 50 мкл. Предусмотрите инфицирование 3 повторностей в лунках для каждого варианта обработки с использованием TrpV и еще 3 повторностей для того же варианта обработки с использованием PLV, чтобы учесть фоновую флуоресценцию, специфичную для каждой обработки. Инфицируйте лунки, добавив 50 мкл/лунку разведенного вируса в среде для инфицирования. Этот момент определяет время = 0 ч после инфицирования (0 hpi). Инкубируйте от 6 до 24 часов в инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂. 3. Фиксация клеток Зафиксируйте клетки, добавив 100 мкл 8% параформальдегида к среде для инфицирования, уже находящейся в каждой лунке. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 мин в защищенном от света месте. ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется добавлять 2x параформальдегид (8%) непосредственно в среду для инфицирования, чтобы предотвратить аэрозолизацию инфекционной вакцинии, которая может произойти, если среду с высоким титром выливают прямо в емкость для отходов перед фиксацией. Удалите фиксатор, перевернув планшет над емкостью для отходов. Добавьте 100 мкл фосфатно-солевого буфера комнатной температуры. Запечатайте планшет оптически прозрачной адгезивной пленкой. ПРИМЕЧАНИЕ: Планшеты можно хранить при 4 °C, если считывание проводится не сразу. Обязательно доведите запечатанные планшеты до комнатной температуры перед считыванием, чтобы предотвратить образование конденсата, который может исказить измерения спектрофотометра. Розелл, Д. К., и др. Репортерные вирусы вакцинии для количественного анализа функций вируса на всех стадиях экспрессии генов. J. Vis. Exp. (2014)

В данном видео демонстрируется метод мониторинга репликации вируса вакцинии с использованием флуоресцентных репортеров, регулируемых стадийно-специфичными промоторами. Последовательная экспрессия зеленого, красного и синего флуоресцентных белков отмечает раннюю, промежуточную и позднюю фазы инфекции, что позволяет проводить высокопроизводительный анализ стадийно-специфичной экспрессии вирусных генов.

Протокол

1. Посев клеток

1. Отделите клетки HeLa от планшета и разведите в ростовой среде (модифицированная Дульбекко среда Игла [DMEM], 2 mM L-glut, 10% эмбриональной бычьей сыворотки [FBS]) до концентрации примерно 2.0 x 10⁵ клеток/мл. Расположите по 100 μl/лунку в 96-луночный планшет с черными стенками и прозрачным плоским дном (20 000 клеток/лунку).
2. Инкубируйте клетки в течение 24 ч до достижения конфлюэнтности в инкубаторе при 37 °C + 5% CO₂.

2. Инфицирование клеток

1. Разведите вирусы и инфицируйте клетки.
   1. Разморозьте флуоресцентные вирусы TrpV (тройной вирус; ранний Venus, промежуточный mCherry, поздний TagBFP) и PLV (Venus без промотора) и дезагрегируйте их с помощью соникации в течение 5 минут. В качестве альтернативы неочищенные стоки вируса можно смешать в соотношении 1:1 с 0.25 mg/ml трипсина в среде для инфекции и инкубировать при 37 °C в течение 30 мин.
   2. Разведите неочищенные стоки вируса в среде для инфекции при 37 °C (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). Для инфекций с высоким MOI (10 PFU/cell) разведите сток вируса до 1.0 x 10⁷ PFU/ml, исходя из 5 x 10⁴ клеток/лунку и объема инокулята 50 μl. Запланируйте инфицирование 3 повторных лунок для каждого варианта обработки с использованием TrpV и еще 3 повторных лунок для той же обработки с использованием PLV, чтобы учесть фоновую флуоресценцию, специфичную для каждого варианта.
   3. Инфицируйте лунки, добавив 50 μl/лунку разведенного вируса в среде для инфекции. Этот момент определяется как время = 0 ч после инфекции (0 hpi).
2. Инкубируйте 6-24 ч в инкубаторе при 37 °C + 5% CO₂.

3. Фиксация клеток

1. Зафиксируйте клетки, добавив 100 μl 8% параформальдегида к среде для инфицирования, которая уже находится в каждой лунке. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 мин в защищенном от света месте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется добавлять 2x параформальдегид (8%) непосредственно в среду для инфицирования, чтобы предотвратить аэрозолизацию инфекционного вируса вакцинии, которая может произойти, если среду с высоким титром выливают непосредственно в емкость для отходов до фиксации.
2. Удалите фиксатор, перевернув планшет над емкостью для отходов.
3. Добавьте 100 μl фосфатно-солевого буферного раствора комнатной температуры.
4. Герметично закройте планшет оптически прозрачной адгезивной пленкой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если измерение не проводится немедленно, планшеты можно хранить при 4 °C. Перед считыванием обязательно доведите запечатанные планшеты до комнатной температуры, чтобы конденсат не исказил результаты измерений на спектрофотометре.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM)	Gibco	11995-065
Сыворотка новорожденного теленка — Optima, инактивированная нагреванием (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-глутамин (L-glut)	Gibco	25030-081
96-луночные микропластины из черного полистирола с плоским прозрачным дном, обработанные для культивирования тканей	Corning	3603
Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS)	Gibco	10010-023
Оптически прозрачная пленка TempPlate RT	USA Scientific	2978-2700
Среда Opti-MEM с пониженным содержанием сыворотки	Gibco	31985-070