Выделение и очистка вирусов из тел инфицированных насекомых

Аннотация

Экстракция цельного вируса Гомогенизируйте целые тела вирус-положительных *H. vitripennis* в фосфатном буфере (pH ~7,2) с добавлением 0,02% тригидрата диэтилдитиокарбамата натрия (DETCA) путем вортексирования интервалами по ~10 сек до полного исчезновения крупных фрагментов тканей. Экстрагируйте вирус с помощью ультрацентрифугирования при 124 500 x g в течение 4 ч при 4 °C или при 22 000 x g в течение 16 ч при 4 °C. При образовании осадка на поверхности удалите его стерильным ватным тампоном. Удалите супернатант. Соберите осадок и растворите его в 5 мл 10 мМ фосфатного буфера (без DETCA), pH ~7,2, содержащего 0,4% на-дезоксихолевой кислоты и 4% полиэтиленгликольгексадецилового эфира (Brij 52). Для тщательного перемешивания осадка, при необходимости, отделите его от стенки пробирки и раздробите до полного растворения. Если потребуется, добавляйте по 10 мМ фосфатного буфера порциями по ~5 мл для облегчения растворения осадка и распределите полученный раствор по двум пробиркам. Центрифугируйте раствор при 300 x g в течение 15 мин. Удалите супернатант, пропустите раствор через фильтр с размером пор 0,45 мкм и соберите фильтрат в большую пробирку. Перенесите фильтрат в диализную мембрану с пределом отсечения по молекулярной массе (MWCO) 3,5 кДа, при необходимости используя небольшое количество 10 мМ фосфатного буфера (pH 7) без DETCA. Поместите диализную мембрану в большой стакан с двойной дистиллированной водой (ddH2O) при 4 °C. Меняйте ddH2O каждый час в течение 5–6 ч, пока в мембране не образуется белый осадок. Соберите очищенный вирус из мембраны и подвергните 100%-ный раствор вируса 10-кратному последовательному разведению, добавляя 10 мкл раствора к 90 мкл ddH2O. Затем добавляйте 10 мкл разведения к следующим 90 мкл ddH2O до достижения разведения 1:100 000. Храните раствор вируса при -80 °C. Бисброк, А. М. и др. Репликация Вирус Homalodisca coagulata-01 посредством Homalodisca vitripennis Клеточная культура. J. Vis. Exp. (2014)

В данном видео демонстрируется размножение вируса Homalodisca coagulata Virus-01 in vitro с использованием клеточных линий насекомых. В нем подробно описываются этапы очистки вируса, инокуляции и репликации в культуре клеток насекомых.

Протокол

1. Экстракция цельного вируса

1. Гомогенизируйте целые тела H. vitripennis, положительные по вирусу, в фосфатном буфере (pH ~7,2) с 0,02% тригидрата диэтилдитиокарбамата натрия (DETCA), перемешивая на вортексе интервалами по ~10 сек до полного исчезновения крупных фрагментов ткани. Выделите вирус методом ультрацентрифугирования при 124 500 x g в течение 4 ч при 4 °C или при 22 000 x g в течение 16 ч при 4 °C. При образовании осадка на поверхности удалите его стерильным ватным тампоном.
2. Удалите супернадант.
3. Соберите осадок и растворите его в 5 мл 10 mM фосфатного буфера (без DETCA), pH ~7,2, содержащего 0,4% Na-дезоксихолевой кислоты и 4% полиэтиленгликольгексидецилового эфира (Brij 52).
   1. Для тщательного перемешивания осадка при необходимости отделите его от стенки пробирки и раздавите до полного растворения.
   2. При необходимости добавьте дополнительный 10 mM фосфатный буфер порциями по ~5 мл для полного растворения осадка, затем распределите раствор в 2 пробирки.
4. Центрифугируйте раствор при 300 x g в течение 15 мин.
5. Удалите супернадант, пропустите раствор через фильтр с размером пор 0,45 μm и соберите фильтрат в большую пробирку.
6. Перенесите фильтрат в диализную мембрану с пределом отсечения по молекулярной массе (MWCO) 3,5 kD, при необходимости используя небольшое количество 10 mM фосфатного буфера (pH 7) без DETCA.
7. Поместите диализную мембрану в большой стакан с ddH₂O при 4 °C. Заменяйте ddH₂O каждый час в течение 5–6 ч до образования белого осадка внутри мембраны.
8. Соберите очищенный вирус из мембраны и приготовьте серию десятикратных разведений 100% вирусного раствора, добавляя 10 μl раствора к 90 μl ddH₂O. Затем последовательно добавляйте 10 μl разведения к другим 90 μl ddH₂O до достижения разведения 1:100 000.
9. Храните вирусный раствор при -80 °C.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Флаконы для культивирования клеток Corning	Sigma Aldrich	CLS430168	Площадь поверхности 25 cm², косое горлышко, крышка (пробка-уплотнитель)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71	Olympus		Инвертированный микроскоп и камера
Многолуночные планшеты для культивирования Greiner CELLSTAR	Sigma Aldrich	M8937	48 лунок (с TC-обработкой, с крышкой)
DETCA	Sigma Aldrich	228680	Диэтилдитиокарбамат натрия тригидрат
Вакуумная фильтрационная система для бутылок Corning	Sigma Aldrich	CLS431206	Целлюлозно-ацетатная мембрана, размер пор 0.45 μm, площадь мембраны 54.5 cm², емкость фильтра 500 ml
Brij 52	Sigma Aldrich	388831	Полиэтиленгликольгексидециловый эфир
Фосфатный буферный раствор	Sigma Aldrich	P5244	Поставлен в концентрации 100 mM, разведен до 10 mM стерильной водой
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Фосфатно-солевой буфер
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
Среда Грейса для насекомых (дополненная, 1x)	Sigma Aldrich	G8142	Компонент среды H2G+ для цикадок
L-гистидин моногидрат	Sigma Aldrich	H8125	Компонент среды H2G+ для цикадок
Среда 199 (10x)	Sigma Aldrich	M4530	Компонент среды H2G+ для цикадок
Среда 1066 (1x)	Sigma Aldrich	C0422	Компонент среды H2G+ для цикадок
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (1x)	Sigma Aldrich	51322C	Компонент среды H2G+ для цикадок
L-глутамин (100x)	Sigma Aldrich	G3126	Компонент среды H2G+ для цикадок
MEM, смесь аминокислот (50x)	Sigma Aldrich	56419C	Компонент среды H2G+ для цикадок
1 M раствор MgCl	Sigma Aldrich	M8266	Компонент среды H2G+ для цикадок
Pen-Strep	Sigma Aldrich	G6784	Компонент среды H2G+ для цикадок
Нистатин	Sigma Aldrich	N6261	Компонент среды H2G+ для цикадок
Гентамицин	Sigma Aldrich	46305	Компонент среды H2G+ для цикадок
Декстроза	Sigma Aldrich	D9434	Компонент среды H2G+ для цикадок
Фетальная бычья сыворотка	Sigma Aldrich	F2442	Компонент среды H2G+ для цикадок