Получение рекомбинантного лентивируса в клетках млекопитающих

Аннотация

Создание системы концентрированного упаковки лентивируса для факторов транскрипции Производство концентрированного вируса (Рисунок 1A, B) 1.1. Посейте 1,5 × 10⁶ клеток HEK-293T (эмбриональные почки человека) в чашку 60 мм и культивируйте эти клетки в обычной среде (см. таблицу 1) при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂. ПРИМЕЧАНИЕ: Если вирус необходимо упаковывать партиями, можно использовать чашку для культивирования клеток диаметром 100 мм (подробности см. в таблице 2). 1.2. Через 24 ч убедитесь, что в день трансдукции клетки HEK-293T достигли 80–90% конфлюэнтности, и замените среду на 3,5 мл DMEM (среда DMEM с модификацией по Дульбекко) (150 мкл DMEM на 1 см²). Выдержите клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂ в течение 2 ч. ПРИМЕЧАНИЕ: Заменяющая среда должна быть безсывороточной, чтобы клетки подверглись «голоданию» для более эффективной трансфекции плазмид. 1.3. Подготовьте смесь плазмид (смесь A), содержащую 3 мкг целевых плазмид Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 или Snai2; 1 мкг упаковочной плазмиды PMD2.G и 2 мкг упаковочной плазмиды PSPAX2. Доведите объем смеси A до 150 мкл с помощью безсывороточной среды DMEM. Подготовьте смесь трансфекционного реагента (смесь B), добавив 12 мкл трансфекционного реагента (объем равен удвоенной общей массе всех плазмид), и доведите объем смеси B до 150 мкл с помощью безсывороточной среды DMEM. ПРИМЕЧАНИЕ: При приготовлении смесей важно добавлять жидкость медленно, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. 1.4. Соедините смесь A и смесь B после их выдерживания в течение 5 мин при комнатной температуре. Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 20–30 мин для формирования трансфекционного комплекса. 1.5. Извлеките клетки HEK-293T из инкубатора, замените среду на DMEM + 2% FBS (фетальная бычья сыворотка), по каплям добавьте смесь из шага 1.1.4 и осторожно перемешайте жидкость. 1.6. Через 8 ч замените среду на 3,5 мл обычной среды. После замены среды собирайте супернатанты вируса каждые 24 ч и 48 ч. 1.7. Смешайте супернатанты вируса, собранные в две разные временные точки. Центрифугируйте при 200 × g в течение 5 мин при 4 °C. Пропустите супернатант через фильтры 0,45 мкм и соберите его в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл. ПРИМЕЧАНИЕ: Вирус, собранный через 24 ч, можно хранить при 4 °C и смешать с вирусом, собранным через 48 ч. 1.8. Концентрируйте супернатант вируса путем центрифугирования при 6000 × g при 4 °C в течение ночи (~16 ч). Убедитесь, что после центрифугирования на дне конической пробирки виден вирусный осадок. 1.9. Медленно слейте супернатант. Растворите вирусный осадок в объеме обычной среды, составляющем 1/100 от объема супернатанта вируса. Используя микропипетку P1000, осторожно пипетируйте содержимое вверх и вниз до получения однородной смеси. Разделите концентрированный вирус по микроцентрифужным пробиркам по мере необходимости. Храните при −80 °C. ПРИМЕЧАНИЕ: Данным методом вирус концентрируется в 100 раз. Концентрированный вирус (100x) можно хранить более 1 года при −80 °C. Избегайте повторного замораживания и размораживания вируса. Таблица 1: Компоненты обычной и репрограммирующей сред. Компоненты | Доза (концентрация, объем) | Конечная концентрация --- | --- | --- Обычная среда (100 мл) | | DMEM/HIGH GLUCOSE | 89 мл | Термоинактивированная FBS | 10 мл | Антибиотики (Pen/Strep) | 10000 Ед/мл, 1 мл | 100 Ед/мл Репрограммирующая среда (100 мл) | | RPMI-1640 | 88 мл | Термоинактивированная FBS | 10 мл | Рекомбинантный SCF человека | 200 мкг/мл, 50 мкл | 100 нг/мл Рекомбинантный bFGF человека | 4 мкг/мл, 250 мкл | 10 нг/мл Рекомбинантный инсулин человека | 10 мг/мл, 50 мкл | 5 мкг/мл EDN3 человека | 100 мкМ, 100 мкл | 0,1 мкМ Холерный токсин | 0,3 мг/мл, 0,56 мкл | 20 пМ Форбол-12-миристат-13-ацетат (TPA) | 1 мМ, 20 мкл | 200 нМ Гидрокортизон | 100 мкг/мл, 500 мкл | 0,5 мкг/мл Аденин | 40 мг/мл, 60 мкл | 24 мкг/мл Таблица 2: Параметры системы упаковки лентивируса. Чашка для культивирования | Плотность посева (клеток/чашку) | Среда (мл) | Система плазмид | Трансфекционный реагент (мкл) | Целевая плазмида (мкг) | PMD2.G (мкг) | PSPAX2 (мкг) --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- 35 мм | 6 × 10⁵ | 1,5 | 1,5 | 0,5 | 1 | 6 | 6 60 мм | 1,5 × 10⁶ | 3,5 | 3 | 1 | 2 | 1 | 2 100 мм | 4 × 10⁶ | 8 | 8 | 3 | 6 | 3 | 4 Чжан, Ю., и др.Прямое перепрограммирование фибробластов мыши в меланоциты. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео демонстрируются методы получения и концентрирования рекомбинантного лентивируса в клетках млекопитающих, что позволяет эффективно доставлять транскрипционные факторы или другие генетические элементы для таких целей, как клеточное репрограммирование, функциональные исследования и потенциальные терапевтические разработки.

Протокол

1. Создание системы концентрированного упаковки лентивируса для факторов транскрипции

1. Получение концентрированного вируса (Рисунок 1A, B)
   1. Посейте 1,5 × 10⁶ Посейте клетки HEK (эмбриональная почка человека)-293T в чашку диаметром 60 мм и культивируйте их в нормальной среде (см. Таблица 1) при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2₂.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется упаковывать вирус партиями, можно использовать чашку для культивирования клеток диаметром 100 мм (подробности см. в Таблица 2).
   2. Через 24 ч, убедившись, что в день трансдукции клетки HEK-293T достигли 80–90% конфлюэнтности, замените среду на 3,5 мл DMEM (модифицированной среды Игла по Дульбекко) (150 µL мл DMEM на 1 см²²). Оставьте клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2₂ в течение 2 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заменяющая среда должна быть безсывороточной, чтобы клетки могли быть "голоданием" для более эффективной трансфекции плазмидами.
   3. Приготовьте смесь плазмид (смесь А), содержащую 3 µg целевых плазмид Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 или Snai2; 1 µg упаковочной плазмиды PMD2.G и 2 µg упаковочной плазмиды PSPAX2. Доведите объем смеси А до 150 µL бессывороточным DMEM. Приготовьте смесь реагента для трансфекции (смесь B), добавив 12 µL трансфекционного реагента (объем в два раза превышает общую массу всех плазмид), и доведите объем смеси B до 150 µL бессывороточным DMEM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При подготовке смесей важно медленно добавлять жидкость, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
   4. Смешайте смесь А и смесь Б после выдержки в течение 5 мин при комнатной температуре. Инкубируйте полученную смесь при комнатной температуре в течение 20–30 мин для формирования трансфекционного комплекса.
   5. Извлеките клетки HEK-293T из инкубатора, замените среду на DMEM + 2% FBS (фетальная бычья сыворотка), по каплям добавьте смесь, приготовленную на этапе 1.1.4, и аккуратно перемешайте жидкость.
   6. Через 8 ч замените среду на 3,5 мл нормальной среды. После замены среды собирайте супернатант вируса через 24 и 48 ч.
   7. Смешайте супернатанты вируса, собранные в два разных временных интервала. Центрифугируйте при 200 × g в течение 5 мин при 4 °CПропустите супернатант через 0.45 µm фильтры и соберите его в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вирус, собранный через 24 ч, можно хранить при 4 °C и смешанный с вирусом, собранным через 48 ч.
   8. Концентрируйте супернатант вируса путем центрифугирования при 6000 × g при 4 °C в течение ночи (~16 ч). Убедитесь, что после центрифугирования на дне конической пробирки виден вирусный осадок.
   9. Медленно слейте супернатант. Растворите вирусный осадок в объеме обычной среды, составляющем 1/100^th объема супернатанта вируса. С помощью микропипетки P1000 осторожно перемешивайте содержимое путем перемещения жидкости вверх и вниз до получения гомогенной смеси. Разлейте концентрированный вирус по микроцентрифужным пробиркам в зависимости от необходимости. Хранить при −80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данным методом вирус концентрируется в 100 раз. Концентрированный вирус (100x) можно хранить в течение >1 год при −80 °CИзбегайте повторного замораживания и оттаивания вируса.

Таблица 1: Компоненты стандартной среды и среды для репрограммирования.

	Компоненты	Доза (концентрация, объем)	Конечная концентрация
Обычная среда (100 mL)	DMEM/HIGH GLUCOSE	89 mL
	Термоинактивированная FBS	10 mL
	Антибиотики (Pen/Strep)	10000 U/mL, 1 mL	100 U/mL
Среда для репрограммирования (100 mL)	RPMI-1640	88 mL
	Термоинактивированная FBS	10 mL
	Рекомбинантный SCF человека	200 μg/mL, 50 μL	100 ng/mL
	Рекомбинантный bFGF человека	4 μg/mL, 250 μL	10 ng/mL
	Рекомбинантный инсулин человека	10 mg/mL, 50 μL	5 μg/mL
	Человеческий EDN3	100 μM, 100 μL	0.1 μM
	Холерный токсин	0.3 mg/mL, 0.56 μL	20 pM
	Форбол-12-миристат-13-ацетат (TPA)	1 mM, 20 μL	200 nM
	Гидрокортизон	100 μg/mL, 500 μL	0.5 μg/mL
	Аденин	40 mg/mL, 60 μL	24 μg/mL

Таблица 2: Подробные сведения о системе упаковки лентивируса.

Чашка для культивирования	Плотность посева (клеток/чашку)	Среда (mL)	Система плазмид			Реагент для трансфекции (µL)
			Целевая плазмида (μg)	PMD2.G (μg)	PSPAX2 (μg)
35 mm	6 ×105	1.5	1.5	0.5	1	6
60 mm	1.5 × 106	3.5	3	1	2	12
100 mm	4 × 106	8	8	3	6	34

Результаты

Рисунок 1: Получение концентрированного вируса и определение титра. (A) Интенсивность флуоресценции GFP (зеленого флуоресцентного белка) после инфицирования клеток HEK-293T неконцентрированным лентивирусом (1x) и концентрированным лентивирусом (100x). (B) Сравнение показателей эффективности инфицирования неконцентрированным лентивирусом (1x) и концентрированным лентивирусом (100x), определенное с помощью проточной цитометрии. (C) Определение титра концентрированного лентивируса. Масштабные отрезки = 250 µm. Сокращения: GFP = зеленый флуоресцентный белок; TU = трансдуцирующие единицы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фильтр 0.45 μM	Millipore	SLHVR33RB
Этанол 95%/100%	LANBAO	210106	Хранить при комнатной температуре
Антибиотики (Pen/Strep)	Gibco	15140-122	Хранить при -20 °C
Антитела к TRP2/DCT	Abcam	ab74073	Хост/Изотип: Rabbit IgG. Перекречная реактивность: мышь/человек. Разведение для использования 1:200
DMEM (с высоким содержанием глюкозы)	HyClone	SH30243.01	Хранить при 4 °C
DMSO	Sigma	D2650	Хранить при комнатной температуре
FBS	Gibco	10270-106	Хранить при -20 °C. Перед использованием инактивировать нагреванием
Желатин	Sigma	G9391	Хранить при комнатной температуре
Плазмиды GFP-PURO (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 и Snai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	Хранить при -20 °C
Гематоксилин	Abcam	ab220365	Хранить при комнатной температуре
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Реагент для трансфекции, хранить при 4 °C
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	Хранить при комнатной температуре
Форбол 12-миристат 13-ацетат (TPA)	Sigma	P8139	Исходная концентрация 1 mM. Конечная концентрация 200 nM
Полибрен	Sigma	H9268	Катионный полимерный реагент для трансфекции; исходная концентрация 8 μg/µL. Конечная концентрация 4 ng/µL
Пуромицин	Gibco	A11138-03	Хранить при -20 °C
Рекомбинантный bFGF человека	Invitrogen	13256-029	Исходная концентрация 4 μg/mL. Конечная концентрация 10 ng/mL
Рекомбинантный инсулин человека	Sigma	I3536	Исходная концентрация 10 mg/mL. Конечная концентрация 5 µg/mL