Трансфекция клеток-продуцентов для первичного получения вирусоподобных частиц, способных к транскрипции и репликации (trVLP) Через 24 часа после рассадки клеток (общий график проведения эксперимента см. на Рисунке 1) с помощью наконечников с фильтром перенесите плазмидную ДНК (количество см. в Таблице 1) в стерильную криопробирку объемом 2 мл. Добавьте к ДНК по 100 мкл OptiMEM на каждую лунку. Кратковременно перемешайте смесь на вортексе и аккуратно осадите содержимое пробирок в микроцентрифуге. Если несколько лунок подлежат трансфекции идентичными плазмидами, можно приготовить общую смесь (мастер-микс) на несколько лунок. Перед использованием кратковременно перемешайте флакон с Transit LT1 на вортексе. Добавьте к разведенной ДНК по 7,5 мкл Transit LT1 на каждую лунку. Аккуратно перемешайте смесь на вортексе, стараясь не допустить попадания жидкости на крышку криопробирки, и инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре. Осторожно перемешайте трансфекционный комплекс, несколько раз пропипетировав его. Покапельно добавьте по 100 мкл трансфекционных комплексов в каждую лунку. Покачивайте планшет вперед-назад и из стороны в сторону для равномерного распределения комплексов. Не вращайте планшет круговыми движениями, так как это приведет к неравномерному распределению трансфекционных комплексов. Верните клетки в инкубатор. Через 24 часа удалите супернатант из лунок с клетками. Добавьте к клеткам 4 мл среды DMEM (модифицированная Иглом среда Дульбекко) с 5% FBS (фетальная бычья сыворотка), 2 мМ L-глутамина и 1x pen/strep (пенициллин/стрептомицин) (DMEM5). Этот этап можно выполнять одновременно для 3 лунок без риска их высыхания, при условии, что в лунках находятся идентичные образцы (в противном случае, из-за способности trVLP (вирусоподобных частиц, способных к транскрипции и репликации) к самоамплификации в данной системе, может возникнуть проблема перекрестного загрязнения, поэтому в этом случае процедуру следует проводить поочередно для каждой лунки). Верните клетки в инкубатор. Таблица 1. Количество ДНК для трансфекции. Приведено количество каждой плазмиды, необходимое для трансфекции клеток-продуцентов и клеток-мишеней, в нг на одну лунку 6-луночного планшета. | | Клетки-продуценты (p0) | Клетки-мишени (p1 и выше) | | :--- | :--- | :--- | | pCAGGS-NP | 125 | 125 | | pCAGGS-VP35 | 125 | 125 | | pCAGGS-VP30 | 75 | 75 | | pCAGGS-L | 1,000 | 1,000 | | p4cis-vRNA-RLuc | 250 | - | | pCAGGS-T7 | 250 | - | | pCAGGS-Tim1-2 | 50 | - | Хоэнен, Т., и др. Моделирование жизненного цикла вируса Эбола в условиях 2-го уровня биобезопасности с использованием вирусоподобных частиц, содержащих тетрацистронные минигеномы. J. Vis. Exp. (2014)
В данном видео демонстрируется процесс трансфекции клеток человека тетрацистронной плазмиды-минигенома, имитирующей геном вируса Эбола, совместно с вспомогательными плазмидами. Внутри клеток экспрессируются вирусные белки и люцифераза, что приводит к сборке и почкованию непатогенных, репликативно-компетентных вирусоподобных частиц.
