Люциферазный анализ для оценки противовирусных соединений на клетках эмбриональной почки человека

Аннотация

1. Подготовка клеточных культур, инфицированных вирусом кори (MV), экспрессирующим люциферазу светляка (rMV2/Luc) Культивируйте клетки HEK-293T при 37 °C и 5% CO2 в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) со стабилизированным L-глутамином и добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), стрептомицина (100 мкг/мл) и пенициллина (100 МЕ/мл). Пассирование клеток проводят путем трипсинизации каждые 4–5 дней с последующим разведением 1:10 в новом флаконе. Для проведения экспериментов клетки должны находиться в логарифмической фазе роста. В день эксперимента соберите клетки путем трипсинизации и проведите подсчет клеток. Осадите клетки центрифугированием и ресуспендируйте их в культуральной среде до концентрации 3 x 10⁵ клеток/мл. Учтите, что для каждого скринингового планшета требуется 12,5 мл клеточной суспензии. Снова ресуспендируйте клетки в культуральной среде до концентрации 3 x 10⁵ клеток/мл. Учтите, что для каждого скринингового планшета требуется 12,5 мл клеточной суспензии. Дополнительно: добавьте в культуральную среду уридин в концентрации 20 мкг/мл. ПРИМЕЧАНИЕ: При скрининге химических библиотек на наличие ингибиторов репликации вирусов часто выявляются соединения, воздействующие на ранние этапы пути биосинтеза пиримидинов. Добавление уридина в культуральную среду используется для фильтрации таких противовирусных молекул. Действительно, это эффективно восстанавливает репликацию вируса при блокировании вышестоящих ферментов пути биосинтеза пиримидинов. Отберите 1/10 клеточной суспензии для контрольных лунок с неинфицированными клетками, а оставшийся объем используйте для инфицирования. Разморозьте необходимый объем стокового раствора rMV2/Luc. Стоковые растворы MV обычно содержат 10⁶–10⁸ инфекционных частиц на мл. Культуру необходимо инфицировать rMV2/Luc из расчета 0,1 инфекционной частицы на одну клетку-мишень, что соответствует множественности заражения (MOI) 0,1. ПРИМЕЧАНИЕ: rMV2/Luc получен на основе вакцины против кори (штамм Schwarz); работа с ним должна проводиться в условиях уровня биологической безопасности BSL2. Добавьте вирус в клеточную суспензию и осторожно перемешайте. Перенесите инфицированные клетки в желоб и внесите по 100 мкл суспензии инфицированных клеток в колонки со 2-й по 11-ю планшетов D2, содержащих внесенные химические соединения. Суспензию в желобе следует регулярно и осторожно перемешивать. В колонки 1 и 12 внесите по 100 мкл неинфицированных клеток в каждую лунку. В остальные лунки внесите инфицированные клетки. Инкубируйте клетки в течение 24 часов при 37 °C и 5% CO2. 2. Вторичный скрининг на токсичность и противовирусную активность широкого спектра Приготовьте серийные разведения 1:2 для каждого активного соединения (хита) в диметилсульфоксиде (DMSO) в диапазоне от 500 мкМ до 4 мкМ (8 разведений). Заполните белые планшеты для культур тканей с штрихкодом по 50 мкл культуральной среды. Добавьте по 1 мкл каждого разведения соединения в лунки с культурой. Повторите процедуру дважды, чтобы получить 3 планшета с дублирующими серийными разведениями для каждого активного соединения. Приготовьте 37,5 мл суспензии клеток HEK-293T с концентрацией 6 x 10⁵ клеток/мл в культуральной среде, как описано выше (в пунктах 1.1 и 1.2). Разлейте по 12,5 мл в две пробирки Falcon и инфицируйте клетки либо rMV2/Luc при MOI = 0,1, либо рекомбинантным вирусом Чикунгунья (CHIKV), экспрессирующим люциферазу Renilla (CHIKV/Ren), при MOI = 0,2. Перемешайте путем переворачивания пробирки. ПРИМЕЧАНИЕ: CHIKV/Ren получен из дикого штамма CHIKV, поэтому работа с ним должна проводиться в условиях BSL3. Планшеты можно перенести из зоны BSL3 в зону BSL1 после добавления субстрата Renilla в лунки с культурой (см. ниже). Внесите по 50 мкл неинфицированных, инфицированных rMV2/Luc или инфицированных CHIKV/Ren клеток в планшеты с серийными разведениями активных соединений. Инкубируйте в течение 24 часов при 37 °C. Добавьте по 50 мкл субстрата люциферазы светляка для определения активности люциферазы светляка в лунках, инфицированных rMV2/Luc. Добавьте по 50 мкл субстрата люциферазы Renilla для определения активности люциферазы Renilla в лунках, инфицированных CHIKV/Ren. Наконец, добавьте по 50 мкл реагента для анализа жизнеспособности на основе люциферазы в лунки с неинфицированными клетками для определения жизнеспособности клеток. Постройте график данных (Рисунок 1) и определите концентрации активных соединений, которые ингибируют репликацию MV и CHIKV на 50%. Исключите соединения, проявляющие токсичность в данном анализе. Lucas-Hourani, M. и др., Высокопроизводительный скрининг химических ингибиторов РНК-вирусов широкого спектра действия. J. Vis. Exp. (2014)

В этом видео представлен противовирусный анализ на основе люциферазы с использованием клеток эмбриональной почки человека, инфицированных рекомбинантным вирусом кори. Показано, что серийно разведенные исследуемые соединения ингибируют репликацию вируса, что приводит к дозозависимому снижению люминесценции при сохранении жизнеспособности клеток хозяина.

Протокол

1. Подготовка клеточных культур, инфицированных вирусом кори (MV), экспрессирующим люциферазу светлячка (rMV2/Luc)

1. Культивируйте клетки HEK-293T при 37 °C и 5% CO₂ в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) со стабилизированным L-глутамином и добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), стрептомицина (100 μg/ml) и пенициллина (100 IU/ml). Пассаж клеток проводят путем трипсинизации каждые 4-5 дней с разведением 1:10 в новой колбе. Для проведения экспериментов клетки должны находиться в логарифмической фазе роста.
2. В день эксперимента соберите клетки путем трипсинизации и проведите подсчет клеток. Осадите клетки центрифугированием и ресуспендируйте их в культуральной среде до концентрации 3 x 10⁵ клеток/ml. Учитывайте, что для каждого скринингового планшета требуется 12,5 ml суспензии клеток.
3. Снова ресуспендируйте клетки в культуральной среде до концентрации 3 x 10⁵ клеток/ml. Учитывайте, что для каждого скринингового планшета требуется 12,5 ml суспензии клеток.
4. Дополнительно: добавьте в культуральную среду уридин в концентрации 20 μg/ml.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При скрининге химических библиотек на поиск ингибиторов репликации вирусов часто выявляются соединения, воздействующие на ранние этапы пути биосинтеза пиримидинов. Добавление уридина в культуральную среду используется для отсеивания таких противовирусных молекул. Действительно, это эффективно восстанавливает репликацию вируса при блокировании вышележащих ферментов пути биосинтеза пиримидинов.
5. Отберите 1:10 суспензии клеток для контрольных лунок с неинфицированными клетками, а оставшийся объем используйте для инфицирования.
6. Разморозьте необходимый объем стокового раствора rMV2/Luc. Стоковые растворы MV обычно имеют концентрацию 10⁶-10⁸ инфекционных частиц на ml. Культуру необходимо инфицировать 0,1 инфекционной частицей rMV2/Luc на одну клетку-мишень, что соответствует множественности заражения (MOI) 0,1. 
   ПРИМЕЧАНИЕ: rMV2/Luc получен из вакцины против кори (штамм Schwarz) и должен использоваться в условиях уровня биобезопасности BSL2.
7. Добавьте вирус в суспензию клеток и осторожно перемешайте. Перенесите инфицированные клетки в многоканальный дозатор и внесите по 100 μl суспензии инфицированных клеток в колонки со 2-й по 11-ю планшетов D2, содержащих исследуемые химические соединения. Суспензию клеток в дозаторе следует регулярно осторожно перемешивать.
8. В колонки 1 и 12 внесите по 100 μl неинфицированных клеток в каждую лунку. В остальные лунки внесите инфицированные клетки.
9. Инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO₂.

2. Вторичный скрининг на токсичность и противовирусную активность широкого спектра

1. Приготовьте серийные разведения 1:2 для каждого активного соединения в диметилсульфоксиде (DMSO), начиная от 500 µM до 4 µM (8 разведений). Заполните белые штрих-кодированные планшеты для культивирования тканей 50 µl культуральной среды. Добавьте по 1 µl каждого разведения соединения в лунки для культивирования. Повторите процедуру дважды, чтобы получить 3 культуральных планшета с дублирующими серийными разведениями для каждого активного соединения.
2. Приготовьте 37,5 ml суспензии клеток HEK-293T с концентрацией 6 x 10⁵ клеток/ml в культуральной среде, как описано выше (в пунктах 1.1 и 1.2). Разлейте по 12,5 ml в две пробирки Falcon и инфицируйте клетки либо rMV2/Luc при MOI = 0,1, либо рекомбинантным вирусом чикунгунья (CHIKV), экспрессирующим люциферазу Renilla (CHIKV/Ren), при MOI = 0,2. Перемешайте путем переворачивания пробирок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: CHIKV/Ren получен из дикого штамма CHIKV, поэтому работа с ним должна проводиться в условиях уровня биобезопасности BSL3. Планшеты можно перенести из зоны BSL3 в зону BSL1 после добавления субстрата Renilla в лунки с культурами (см. ниже).
3. Раздайте по 50 µl неинфицированных, инфицированных rMV2/Luc или инфицированных CHIKV/Ren клеток в культуральные планшеты, содержащие серийные разведения активных соединений. Инкубируйте в течение 24 ч при 37 °C.
4. Добавьте 50 µl субстрата люциферазы светлячка для определения активности люциферазы светлячка в лунках, инфицированных rMV2/Luc. Добавьте 50 µl субстрата люциферазы Renilla для определения активности люциферазы Renilla в лунках, инфицированных CHIKV/Ren. В завершение добавьте 50 µl реагента для анализа жизнеспособности на основе люциферазы к неинфицированным клеткам для определения клеточной жизнеспособности.
5. Постройте график по полученным данным (Рисунок 1) и определите концентрации активных соединений, которые подавляют репликацию MV и CHIKV на 50%. Исключите соединения, проявившие токсичность в данном анализе.

Результаты

Рисунок 1. Дозозависимая противовирусная активность и токсичность соединений C864, C648 и C062. (A) Клетки HEK-293T инфицировали штаммом rMV2/Luc вируса кори, экспрессирующим люциферазу (MOI=0.1), и инкубировали с возрастающими дозами C864, C648, C062 или только с DMSO. Через 24 ч определяли экспрессию люциферазы. * указывает на то, что наблюдаемое ингибирование люциферазы было статистически значимым для всех трех соединений (p-values < 0.05). (B) Клетки HEK-293T инфицировали штаммом CHIKV/Ren вируса Чикунгунья, экспрессирующим Renilla-люциферазу (MOI=0.2), и инкубировали с возрастающими дозами C864, C648, C062 или только с DMSO. Через 24 ч определяли экспрессию Renilla-люциферазы. * указывает на статистически значимое ингибирование для всех трех соединений (p-values < 0.05). (C) Клетки HEK-293T инкубировали с возрастающими дозами C864, C648, C062 или только с DMSO. В качестве контроля токсичности в клеточные культуры добавляли 2.5 μl 0.5% раствора IGEPAL. Через 24 ч определяли количество живых клеток с помощью анализа жизнеспособности на основе люциферазы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Платформа Freedom EVO	TECAN		Роботизированная платформа
96-луночные полистирольные микропланшеты для культивирования клеток, белые	Greiner Bio One	655083
Люминесцентный анализ жизнеспособности клеток CellTiter-Glo	Promega	G7570	Люциферазный анализ жизнеспособности клеток
Система анализа люциферазы Bright-Glo	Promega	E2610	Реагент, содержащий субстрат люциферазы светлячка
Система анализа люциферазы Renilla-Glo	Promega	E2710	Реагент, содержащий субстрат Renilla-люциферазы
Система анализа репортерных генов Britelite plus	Perkin-Elmer	6016761	Реагент, содержащий субстрат люциферазы светляка. Может использоваться в качестве альтернативы реагенту Bright-Glo для определения активности люциферазы.