Изоляция одного гигантского вируса из смешанной вирусной популяции с использованием амеб

Аннотация

Источник: Sahmi-Bounsiar, D. et al. Микроаспирация одиночных клеток как альтернативная стратегия флуоресцентной сортировки клеток для разделения смеси гигантских вирусов. J. Vis. Exp. (2019)

В данном видео демонстрируется метод микроаспирации единичных клеток для изоляции и экспансии популяции одного вида гигантских вирусов из смешанной вирусной популяции с использованием амеб в качестве клеток-хозяев.

Протокол

1. Культивирование амеб

1. Используйте Vermamoeba vermiformis (штамм CDC19) в качестве клеточной поддержки.
2. Добавьте 30 mL среды протеаза-пептон-дрожжевой экстракт-глюкоза (PYG) (Таблица 1) и 3 mL суспензии амеб с концентрацией 1 x 10⁶ клеток/mL в культуральный флакон площадью 75 cm².
3. Поддерживайте культуру при температуре 28 °C.
4. Через 48 ч определите количество амеб с помощью счетных камер.
5. Для промывки соберите клетки с концентрацией 1 x 10⁶ клеток/mL и осадите амебы центрифугированием при 720 x g в течение 10 мин. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в соответствующем объеме среды для голодания, чтобы получить концентрацию 1 x 10⁶ клеток/mL (Таблица 1).

2. Разведение до предела

1. Выполните серийное разведение (от 10^-1 до 10^-11) образца вируса в среде голодания (Таблица 1).
2. Инокулируйте 2 мл суспензии Vermamoeba vermiformis в концентрации 1 x 10⁶ в каждой чашке Петри, добавив 100 µL инокулята смеси.
3. Поместите чашки Петри в герметичный пластиковый пакет при температуре 30 °C.
4. Начните наблюдение за чашками Петри с помощью инвертированного оптического микроскопа через 6 ч после инфицирования и проверяйте морфологию клеток каждые 4–8 ч.
5. При появлении цитопатического эффекта, характеризующегося округлением клеток, начните процесс микроаспирации единичных клеток.

3. Микроаспирация единичных клеток

1. Подготовка хозяина
   ПРИМЕЧАНИЕ: Данная подготовка проводится для переноса инфицированных одиночных клеток на свежую клеточную подложку.
   1. Обработайте амеб в культуре противомикробным агентом, содержащим 10 µg/mL ванкомицина, 10 µg/mL имипенема, 20 µg/mL ципрофлоксацина, 20 µg/mL доксициклина и 20 µg/mL вориконазола. Данная смесь используется для предотвращения бактериального и грибкового загрязнения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура проводится на рабочем столе вне микробиологического бокса безопасности. Добавьте по 2 mL концентрированной суспензии амеб (1 x 10⁶ клеток/mL) в 15 чашек Петри. Для адгезии амеб инкубируйте культуру при 30 °C в течение 30 мин.
2. Выберите чашку Петри из серии предельных разведений для проведения микроаспирации в соответствии со следующими критериями: 1) отсутствие видимого загрязнения грибковыми и бактериальными агентами, 2) наличие цитопатического действия вирусов на амеб и 3) фаза прелизиса и округления амеб (чтобы избежать аспирации вирусных частиц).
3. Подготовьте рабочую станцию со следующим оборудованием (Рисунок 1A,B): микманипулятор для позиционирования микрокапилляра; устройство ручного управления давлением для аспирации и выпуска клеток в микрокапилляр; инвертированный микроскоп; моторные модули plug-and-play; камера; компьютерный модуль для визуализации манипуляций и фотофиксации.
4. Выберите микрокапилляр (Рисунок 1C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер клеток, деформация и адгезия их мембран к поверхностям, а также клеточная подвижность могут влиять на плавность хода микроаспирации. Диаметр микрокапилляра может быть точно подобран и адаптирован к конкретным типам клеток в зависимости от их размера и методов аспирации. Для аспирации округлившейся амебы (диаметром ~10 µm) использовался микрокапилляр с внутренним диаметром 20 µm. Это позволяет удерживать клетку внутри и легко ее выпускать.
5. Монтаж системы.
   1. Установите рабочий угол системы захвата на моторизованном модуле под 45°.
   2. Выполните двойную установку: сначала системы захвата, затем микрокапилляра.
   3. Сфокусируйтесь на клетках, предварительно пропустив несколько капель масла через микрокапилляр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Биосовместимое минеральное масло подается самим устройством.
   4. Завершите монтаж в соответствии с рекомендациями производителя.
6. Клонирование клеток (Рисунок 2A,B)
   1. Поместите чашку Петри, содержащую 2 mL инфицированных амеб, под микроскоп.
   2. Сфокусируйтесь сначала на клетках, а затем на микрокапилляре, погруженном в культуру.
   3. Выберите одну округлую клетку и подведите микрокапилляр с помощью микманипулятора.
   4. Осуществите мягкую аспирацию клетки с помощью ручного управления давлением, затянув ее внутрь микрокапилляра. Извлеките одиночную клетку из первого образца и выпустите ее на клеточную подложку, после чего инкубируйте при 30 °C.
   5. Проводите ежедневные наблюдения с помощью инвертированного оптического микроскопа, чтобы следить за видом клеток и появлением цитопатического эффекта.

Таблица 1: Состав культуральных сред

Результаты

Рисунок 1: Материалы для микроманипуляции. (A) Реальная установка рабочей станции. (B) Схематическое изображение компонентов рабочей станции. (C) Схематическое изображение микрокапилляра.

Рисунок 2: Этапы микроаспирации. (A) Процедура изоляции единичной клетки (увеличение x40). (B) Схематическая иллюстрация различных этапов аспирации единичной клетки: 1) Локализация клетки. 2) Аспирация клетки. 3) Этап высвобождения. Черные стрелки указывают на микрокапилляр, белые — на единичную клетку.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Флаконы для культивирования клеток Corning 150 cm²	Sigma-aldrich	CLS430825	Культивирование
Флаконы для культивирования клеток Corning 25 cm²	Sigma-aldrich	CLS430639	Культивирование
Флаконы для культивирования клеток Corning 75 cm²	Sigma-aldrich	CLS430641	Культивирование
Камера DFC 425C	LEICA	Unkown	Наблюдение/мониторинг
Инвертированный микроскоп Eclipse TE2000-S	Nikon	Unkown	Наблюдение/мониторинг
Микрокапилляр 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	Микроаспирация и высвобождение клеток
Микроманипулятор InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Позиционирование микрокапилляра
Чашка Петри 35 mm	Ibidi	81158	Культивирование/наблюдение