1. Приготовление вирусных суспензий Перед изоляцией одиночных вирионов с помощью проточной цитометрии приготовьте нефиксированные вирусные суспензии. Выделите вирусные частицы, используя ранее установленные протоколы, убедившись, что конечная вирусная суспензия находится в TE-буфере (Трис-ЭДТА, pH 8), профильтрованном через мембрану 0,1 мкм. Мы рекомендуем использовать методы тангенциальной потоковой фильтрации (TFF), хотя были разработаны и другие методы с применением химической флокуляции. Определите количество вирусных частиц согласно установленным протоколам, например, с помощью эпифлуоресцентной микроскопии или проточной цитометрии. Разлейте вирусную суспензию по двум пробиркам Eppendorf (рекомендуемый конечный объем — 1000 мкл). 2. Проточная цитометрия Для сортировки вирусов с использованием проточного цитометра BD FACSAria II, оснащенного специализированным ФЭУ прямого светорассеяния (FSC PMT), разведите вирусные частицы в профильтрованном (0,1 мкм) TE-буфере (pH 8,0) до титра, обеспечивающего скорость регистрации событий 200 событий в секунду. Установите пороги так, чтобы максимизировать соотношение сигнал/шум; например, для смешанной популяции, содержащей частицы фагов T4 и лямбда, рекомендуются следующие значения: 1000 для FSC PMT и 200 для SSC. Пропустите 100 мкл «холостых» образцов, содержащих только 1) профильтрованный (0,1 мкм) TE-буфер и 2) профильтрованный (0,1 мкм) TE-буфер с SybrGreen1 в разведении 1e-4 от стока (10 000X). Пропустите небольшую аликвоту (рекомендуется 100 мкл) неокрашенной вирусной суспензии для оценки фона, а затем окрашенную вирусную суспензию (SybrGreen1 в разведении 1e-4 от стока), регистрируя в общей сложности по 5000 событий для каждого образца. Это необходимо для проверки концентрации и, при необходимости, корректировки гейтов сортировки перед началом процесса. Мы рекомендуем устанавливать узкий гейт в центре популяции вирусных частиц. Также для построения гейтов мы используем график зависимости SYBR Green от FSC PMT. Добавьте по 5 мкл 1% низкоплавящего (LMP) агарозы (в TBE-буфере), охлажденной до 37 °C, в каждую лунку предметного стекла из политетрафторэтилена (ПТФЭ) (Electron Microscopy Sciences). Поместите ПТФЭ-стекло в проточный цитометр для сбора отсортированных вирусных частиц. Начните сортировку окрашенных SYBR green вирусных частиц непосредственно на ПТФЭ-стекло с LMP-агарозой. Мы рекомендуем сортировать по 10 или более событий (вирусных частиц) в некоторые лунки, чтобы облегчить определение глубины залегания вирусов при конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). По завершении сортировки извлеките стекло из проточного цитометра и добавьте в каждую лунку еще по 5 мкл LMP-агарозы, охлажденной до 37 °C, чтобы инкапсулировать вирусные частицы. Зайглер Аллен, Л., и др. Изоляция и анализ генома единичных вирионов с помощью метода «геномики единичных вирусов». J. Vis. Exp. (2013).
В данном видео демонстрируется, как проточная цитометрия позволяет изолировать отдельные вирусы, содержащие геном, из смешанных популяций с помощью флуоресцентного детектирования и точной сортировки частиц с последующим встраиванием в агарозу для дальнейшей геномной характеристики.
