1. Сбор образцов. Соберите 70 образцов из различных сред и регионов. В данном случае используйте следующее: 5 образцов грязной воды из деревни Сен-Пьер-де-Мейзоарг (Франция), 15 образцов из озера в парке Борели в Марселе (Франция), 15 образцов морской воды с осадком из скалистых бухт Самены в Марселе (Франция), 25 образцов речной воды из Альп (Франция) и, наконец, 10 образцов сточных вод в Ла-Сьотате (Франция). Перемешайте образцы на вортексе для гомогенизации перед инокуляцией в течение одной минуты при комнатной температуре без какой-либо предварительной обработки. 2. Процедура изоляции. Подготовка хозяина для процедур слепого культивирования и инокуляция образцов. В качестве клеточной опоры для совместного культивирования используйте Vermamoeba vermiformis (штамм CDC19). Культивируйте амебы при 28 °C в культуральном флаконе объемом 75 см² с 30 мл среды с протеазой, пептоном, дрожжевым экстрактом и глюкозой (PYG). Состав среды PYG указан в таблице 1. ПРИМЕЧАНИЕ: Через 48 часов количество амеб определяют путем стандартного подсчета с использованием предметных стекол для подсчета (например, Kovaslides). Соберите клетки при концентрации от 5 x 10⁵ до 10⁶ клеток/мл и осадите амебы центрифугированием при 720 x g в течение 10 мин. Удалите супернатант путем аспирации и ресуспендируйте осадок амеб в 30 мл стерильного физиологического раствора Пейджа для амеб (PAS), см. таблицу 1. Повторите процедуру промывки. Ресуспендируйте амебы в 30 мл голодной среды с добавлением смеси антибиотиков и противогрибковых средств при концентрации примерно 10⁶ амеб/мл. Голодная среда является средой выживания для амебы, позволяющей ей оставаться живой без инцистирования или размножения. Состав указан в таблице 1. ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь антимикробных агентов содержала 10 мкг/мл ванкомицина, 10 мкг/мл имипенема, 20 мкг/мл ципрофлоксацина, 20 мкг/мл доксициклина и 20 мкг/мл вориконазола. Данная смесь служила для снижения бактериального и грибкового загрязнения, которое может замедлить или изменить репликацию вируса. Инокулируйте 25 мкл каждого образца непосредственно в монослой из 200 мкл амеб в 96-луночном планшете с плоским дном, способствующем адгезии амеб, и инкубируйте при 30 °C во влажной среде (влажная среда создается путем размещения влажного компресса внутри пакета с планшетом для предотвращения испарения). Это первичная культура. Оставьте две лунки с амебами без инокуляции образцом; они будут служить в качестве отрицательного контроля. Инкубируйте эту первичную культуру в течение трех дней. Через три дня после первой инокуляции проведите пересев первичной культуры на свежие амебы, как описано выше, без микроскопического исследования. Инкубируйте новый планшет в течение трех дней при тех же условиях, что и первичную культуру. После этих трех дней инкубации проведите финальное культивирование аналогично первичной культуре и пересеву. Инкубируйте финальную культуру в течение двух дней. Затем переходите к детекции. Таблица 1. Рецепты растворов Бу Халиль, Дж. Й.,и др.Быстрая стратегия выделения новых фаустовирусов из проб окружающей среды с использованием Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016)
В данном видео демонстрируется обогащение гигантских вирусов из пробы природной воды с использованием кокультивирования с амебами для последующего детектирования и анализа.
