Количественное определение инфекционного вируса гепатита C методом флуоресцентной микроскопии

Аннотация

Поскольку исходный текст отсутствовал, пожалуйста, предоставьте текст для перевода. Рен, С., и др.Протокол анализа репликации вируса гепатита C. J. Vis. Exp. (2014)

В данном видео демонстрируется метод анализа флуоресцентных фокусов, используемый для количественного определения инфекционного вируса гепатита C в клеточной культуре. В видео показано последовательное разведение вирусного супернатанта, заражение клеток гепатомы и обнаружение сайтов репликации вируса с помощью флуоресцентной микроскопии с применением антител.

Протокол

1. Определение титра вируса

1. Рассейте наивные клетки Huh-7.5.1 с плотностью примерно 3 x 10³ клеток/лунку в 96-луночный планшет. На следующий день выполните 10-кратные серийные разведения бесклеточного культурального супернатанта, полученного из клеток, трансфицированных РНК вируса гепатита C (HCV), используя ростовую среду, и инокулируйте их в трех повторностях на клетки Huh-7.5.1.
2. Зафиксируйте клетки через 72 ч после инфицирования с помощью метанола (в течение 30 мин при -20 ºC) и проведите иммуноокрашивание на белок NS5A HCV.
3. Промойте клетки PBS трижды и заблокируйте с помощью блокирующего буфера для IFA.
4. Используйте кроличьи поликлональные первичные антитела к NS5A или мышиные моноклональные антитела к dsRNA J2 в разведении 1:200 (1 μg/ml) и инкубируйте от 5 ч до ночи при 4 ºC.
5. После инкубации с первичными антителами промойте клетки PBS трижды.
6. Добавьте козьи поликлональные вторичные антитела anti-rabbit IgG-488 или козьи поликлональные вторичные антитела anti-mouse IgG-594 в разведении 1:1,000 (1 μg/ml) и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре.
7. Промойте клетки PBS трижды и изучите их с помощью флуоресцентного микроскопа.
8. Используйте разведение с наибольшим коэффициентом для подсчета NS5A-положительных фокусов и вычислите среднее количество фокус-образующих единиц (FFU) на миллилитр. См. Figure 1 для определения титра HCV.

Результаты

Рисунок 1. Исследование инфекционности HCV дикого типа и измерение титра вируса. A) Для исследований инфекционности использовались наивные клетки Huh-7.5.1. Бесклеточный супернатант, собранный через 48 и 96 ч после трансфекции (hpt) РНК HCV, подвергали десятикратному серийному разведению и добавляли к клеткам в 96-луночном планшете в трех повторностях. Через 72 ч после инфицирования клетки фиксировали и подвергали иммуноокрашиванию на белок NS5A HCV. Клетки с положительным окрашиванием на NS5A (красный цвет) инфицированы вирусом. Для оценки количества фокус-формирующих единиц (FFU) подсчитывали положительные фокусы при максимальном разведении. Представлены репрезентативные панели изображений (масштабная линейка 100 μm). B) На графике показаны средние значения и стандартные отклонения вирусного титра в FFU на миллилитр. Мутант с нулевой активностью полимеразы не продуцировал инфекционные частицы. WT: дикий тип; Pol-: нулевая активность полимеразы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Huh-7.5.1	The Scripps Research Institute		Клеточная линия была любезно предоставлена доктором Фрэнсисом Чизари доктору Арумугасвами в соответствии с подписанным соглашением о передаче материалов (MTA) между The Scripps Research Institute и Cedars-Sinai Medical Center
Мышиные моноклональные антитела к dsRNA J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Козьи антитела к IgG кролика Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
Козьи антитела к IgG кролика Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020