Визуализация подавления транскрипции в инфицированных вирусом клетках

Аннотация

Источник: Кальверам, Б. и др. Использование клик-химии для измерения влияния вирусной инфекции на синтез РНК в клетках хозяина. J. Vis. Exp. (2013)

В данном видео демонстрируется использование клик-химии и флуоресцентной микроскопии для визуализации транскрипции нативных РНК в клетках млекопитающих. В нем показано, как вирусная инфекция подавляет транскрипцию хозяина, путем сравнения флуоресцентных сигналов в инфицированных клетках и контрольных клетках.

Протокол

1. Инфицирование клеток вирусом лихорадки Рифт-Валли (RVFV) штамма MP-12 и мечение нативной РНК 5-этинил-уридином (EU)

   1. Рассейте клетки эмбриональной почки человека 293 (HEK293) в 6-луночный планшет для культивирования тканей в ростовой среде (модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащая 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 U/mL пенициллина, 100 μg/mL стрептомицина). Инкубируйте в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂ до достижения клетками 80–100% конфлюэнтности.
   2. Инфицируйте клетки штаммом MP-12 с множественностью заражения (MOI) 3. Оставьте как минимум две неинфицированные лунки: одна из них будет служить неинфицированным контролем, другая будет обработана актиномицином D (ActD). Удалите ростовую среду и разведите вирусный сток так, чтобы общий объем, добавляемый в каждую лунку, составлял 400 μL. Инкубируйте в течение 1 ч в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂.
   3. Удалите инокулят и добавьте по 2 mL свежей ростовой среды в каждую лунку. Инкубируйте при 37 °C в течение 12 ч.

   ПРИМЕЧАНИЕ: При адаптации данного протокола для использования с другим вирусом рекомендуется провести эксперимент по изучению временной динамики, чтобы определить оптимальный момент для мечения и сбора клеток. Организуйте этот эксперимент таким образом, чтобы время инфицирования было разнесено во времени, и все образцы можно было пометить, собрать и окрасить одновременно.

   4. Через 12 часов после инфицирования (hpi) замените ростовую среду средой, содержащей 0.5 mM EU. В одну из лунок с имитацией инфицирования также добавьте 5 μg/mL ActD. Это послужит контролем подавления транскрипции, так как ActD ингибирует ДНК-зависимый синтез РНК. Верните клетки в инкубатор.
   5. Через 13 hpi один раз промойте клетки фосфатно-солевым буфером (PBS) и соберите их путем трипсинизации. Промойте собранные клетки трижды раствором PBS, содержащим 1 mM этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA).

   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом и последующих этапах не центрифугируйте клетки со скоростью более 500-1,000 x g, чтобы предотвратить разрыв клеток. Центрифугируйте клетки в течение 1-2 мин для осаждения.

   ПРИМЕЧАНИЕ: Если после клик-реакции планируется иммуноокрашивание поверхности, вместо трипсинизации используйте резиновый скребок или одноразовый клеточный скребок для сбора клеток.

   6. Фиксируйте клетки, ресуспендировав их в 1 mL 4% параформальдегида (PFA), и инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре (RT).
   7. Один раз промойте 1 mL PBS-EDTA на лунку. Немедленно переходите к шагу 2.

   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно немедленно приступить к клик-реакции, так как РНК деградирует при длительном пребывании на этом этапе. Аналогично, при проведении эксперимента по временной динамике обязательно проводите мечение, фиксацию и окрашивание всех образцов одновременно.

2. Клик-реакция для обнаружения меченой РНК

   1. Пермеабилизуйте клетки, добавив 1 ml 0.2% Triton X-100 в PBS. Инкубируйте в течение 10 мин при RT.

   ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы, используемые в шагах с 2.1 по 2.3, должны быть свободны от нуклеаз.

   2. Трижды промойте 1 ml PBS на лунку.
   3. Извлеките покровные стекла из 12-луночного планшета и перенесите их в увлажненную камеру. На каждое покровное стекло нанесите 50-100 μl раствора для клик-окрашивания (100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO₄, 20 μM флуоресцентного азида [максимумы возбуждения/эмиссии: 590/617 nm], 100 mM аскорбиновой кислоты). Инкубируйте в течение 1 ч при RT в темноте.

   ПРИМЕЧАНИЕ: Для сборки увлажненной камеры застелите дно чашки для культивирования клеток или чашки Петри диаметром 10 см пластиковой парафиновой пленкой. Обложите внутреннюю часть края чашки влажными бумажными полотенцами. Поместите покровные стекла на парафиновую пленку.

   ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы покровные стекла не высыхали на этом или любом другом этапе протокола. Лучше всего добавлять раствор для окрашивания на каждое стекло сразу после его помещения в увлажненную камеру.

   ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте свежий раствор для клик-окрашивания непосредственно перед этим этапом. Стоковые растворы 1.5 M Tris pH 8.5, 100 mM CuSO₄ и 500 mM аскорбиновой кислоты можно хранить при 4 °C. Однако утилизируйте любой стоковый раствор аскорбиновой кислоты, который пожелтел.

   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно выберите флуорофор, соответствующий фильтрам вашего флуоресцентного микроскопа.

   4. Извлеките покровные стекла из увлажненной камеры, поместите их в новый 12-луночный планшет и трижды промойте 1 ml PBS на лунку.
   5. Закрепите покровные стекла, нанеся одну каплю (приблизительно 15 μl) Fluoromount-G на предметное стекло. Окуните покровное стекло в H₂O, удалите излишки H₂O, прижав край к бумажному полотенцу, и поместите его стороной с клетками вниз в каплю Fluoromount-G. Высушите на воздухе в течение 5 мин.

   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании инвертированного микроскопа дайте Fluoromount-G затвердеть при 4 °C в течение ночи или закрепите покровные стекла на предметном стекле, запечатав край прозрачным лаком для ногтей.

   ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды можно сканировать сразу или хранить при 4 °C в темноте до одной недели.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
5-Этинил-уридин	Berry Associates	PY 7563	Растворить в DMSO для приготовления стокового раствора 100 mM
Круглые покровные стекла 12 мм	Fisherbrand	12-545-82
Актиномицин D (ActD)	Sigma	9415	Растворить в DMSO для приготовления стокового раствора 10 mM
Флуоресцентный микроскоп			напр. Olympus IX71
CuSO₄	Sigma	C-8027	Растворить в H₂O для приготовления стокового раствора 100 mM
DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла)	Invitrogen	11965092
FBS (фетальная бычья сыворотка)	Invitrogen	16000044
Флуоресцентный азид (конъюгированный с Alexa Fluor 594)	Invitrogen	A10270
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-аскорбиновая кислота	Sigma	A-5960	Растворить в H₂O до концентрации 500 mM
Параформальдегид	Sigma	158127
Пенициллин-стрептомицин	Invitrogen	15140122
Triton X-100	Sigma	T-8787
Трипсин-EDTA	Invitrogen	25200056
Trizma (основание)	Sigma	T-1503	растворить в H₂O для приготовления стокового раствора 1.5 M, pH 8.5