Анализ вирус-индуцированного подавления транскрипции клетки-хозяина с помощью проточной цитометрии

Аннотация

Источник: Калверам, Б., и др. Использование клик-химии для измерения влияния вирусной инфекции на синтез РНК в клетках хозяина. J. Vis. Exp. (2013)

В данном видео демонстрируется использование клик-химии и проточной цитометрии для измерения вызванного вирусом подавления транскрипции клеток хозяина. Клетки млекопитающих заражают вирусом, экспрессирующим ядерный белок вирулентности, который нарушает работу комплекса факторов транскрипции хозяина, в то время как контрольные клетки остаются транскрипционно активными. Включение 5-этинил-уридина маркирует вновь синтезированную мРНК, что позволяет количественно определить транскрипционную активность в зараженных и контрольных клетках с помощью двойного флуоресцентного детектирования.

Протокол

1. Инфицирование клеток штаммом MP-12 и мечение нативно синтезируемой РНК 5-этинил-уридином (EU)

1. Высейте клетки 293 в 6-луночный планшет для культивирования тканей в ростовой среде (DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 U/ml пенициллина, 100 μg/ml стрептомицина). Инкубируйте в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂ до достижения клетками 80–100% конфлюэнтности.
2. Заразите клетки штаммом MP-12 с m.o.i. равным 3. Оставьте не менее двух незараженных лунок: одна из них будет служить незараженным контролем, а другая будет обработана ActD на этапе 1.4. Удалите ростовую среду и разведите вирусный сток так, чтобы общий объем, добавленный в каждую лунку, составлял 400 μl. Инкубируйте в течение 1 ч в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂.
3. Удалите инокулят и добавьте по 2 ml свежей ростовой среды в каждую лунку. Инкубируйте при 37 °C в течение 12 ч.

ПРИМЕЧАНИЕ: При адаптации данного протокола для использования с другим вирусом рекомендуется провести эксперимент по определению временной зависимости, чтобы установить оптимальный момент для мечения и сбора клеток. Спланируйте этот временной ряд таким образом, чтобы время инфицирования было разнесено во времени, и все образцы можно было метить, собирать и окрашивать одновременно.

4. Через 12 ч. п. и. замените ростовую среду на среду, содержащую 0.5 mM EU. В одну из лунок с ложноинфицированными клетками также добавьте 5 μg/ml ActD. Это послужит контролем подавления транскрипции, так как ActD ингибирует ДНК-зависимый синтез РНК. Верните клетки в инкубатор.
5. Через 13 ч. п. и. один раз промойте клетки PBS и соберите их путем трипсинизации. Промойте собранные клетки трижды с помощью PBS, содержащего 1 mM EDTA (PBS-EDTA).

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом и последующих этапах центрифугируйте клетки при ускорении не более 500 - 1,000 x g, чтобы предотвратить их разрушение. Центрифугируйте клетки в течение 1-2 min до образования осадка.

ПРИМЕЧАНИЕ: Если после клик-реакции планируется иммуноокрашивание поверхности, вместо этого используйте для сбора клеток резиновый полисмен или одноразовый скребок для клеток.

6. Зафиксируйте клетки, ресуспендировав их в 1 ml 4% PFA, и инкубируйте в течение 30 min при RT.
7. Промойте один раз, добавив 1 ml PBS-EDTA на лунку. Сразу переходите к шагу 6.

ПРИМЕЧАНИЕ: Важно немедленно приступить к клик-реакции, так как РНК подвергается деградации при длительном хранении на данном этапе. Аналогичным образом, при проведении эксперимента с временным курсом обязательно маркируйте, фиксируйте и окрашивайте все образцы одновременно.

2. Клик-реакция для детекции меченой РНК

1. Проведите пермеабилизацию клеток, ресуспендировав их в 0,5 ml 0,2% Triton X-100 в PBS. Инкубируйте в течение 10 min при RT.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы, используемые на этапах 2.1–2.3, должны быть свободны от нуклеаз. Если на данном этапе клетки осаждаются недостаточно, увеличьте время центрифугирования до 5 min. Характер осаждения улучшится после суспендирования клеток в буфере для FACS.

2. Однократно промойте 1 ml PBS.

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе не используйте EDTA, так как он хелатирует ионы Cu²⁺, необходимые для клик-реакции.

3. Ресуспендируйте клетки в 200 μl раствора для клик-окрашивания (100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO4, 200nM азида, меченного флуоресцентным красителем [максимум возбуждения/эмиссии: 650/665 nm], 100 mM аскорбиновой кислоты). Инкубируйте в течение 1 ч при RT в темноте.

ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте раствор для клик-окрашивания непосредственно перед выполнением данного этапа. Стоковые растворы 1.5 M Tris pH 8.5, 100 mM CuSO₄ и 500 mM аскорбиновой кислоты можно хранить при 4 °C. Однако следует утилизировать любой стоковый раствор аскорбиновой кислоты, который приобрел желтый цвет. Если на этом этапе клетки слипаются, ресуспендируйте их, несколько раз перенося жидкость из пипетки вверх и вниз. Убедитесь, что выбранный флуорофор может быть детектирован вашим проточным цитометром. Также подготовьте один образец инфицированных клеток, которые не будут подвергаться процедуре клик-окрашивания; они понадобятся для калибровки проточного цитометра. Для этого используйте половину инфицированных клеток или добавьте дополнительную лунку с инфицированными клетками на этапе 1.2.

Промойте дважды буфером для FACS (PBS, содержащий 1 mM EDTA и 0,5% (w/v) BSA).

3. Иммунофлуоресцентный анализ для детекции экспрессии вирусных белков

1. Ресуспендируйте клетки в 200 μl первичных антител (anti-RVFV), разведенных в FACS-буфере (1:10,000), и инкубируйте в течение 1 hr при RT в темноте.

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы этот этап можно проводить в течение ночи при 4 °C в темноте.

ПРИМЕЧАНИЕ: Также подготовьте один образец неинфицированных клеток, которые пройдут процедуру клик-окрашивания, но не будут подвергнуты иммуноокрашиванию; они понадобятся для калибровки проточного цитометра. Для этого используйте половину клеток из группы имитации инфекции или добавьте дополнительную лунку с неинфицированными клетками на этапе 1.2.

ПРИМЕЧАНИЕ: При адаптации данного протокола для использования с другим вирусом сначала определите оптимальное разведение вашего первичного антитела.

2. Дважды промойте клетки в FACS-буфере.
3. Ресуспендируйте клетки в 200 μl вторичного антитела (анти-мышиные IgG, конъюгированные с флуоресцентным красителем [максимум возбуждения/эмиссии: 495/519 nm]), разведенного в FACS-буфере (1:1 000), и инкубируйте в течение 1 ч при RT в темноте.
4. Однократно промойте клетки в FACS-буфере.

ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе клетки можно хранить в течение ночи при 4 °C в темном месте.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
5-этинил-уридин	Berry Associates	PY 7563	растворить в DMSO для приготовления стокового раствора 100 mM
круглые покровные стекла 12 мм	Fisherbrand	12-545-82
полистирольные пробирки 5 мл	BD Biosciences	352058
актиномицин D (ActD)	Sigma	9415	растворить в DMSO для приготовления стокового раствора 10 mM
Alexa Fluor 488 козий анти-мышиный IgG	Invitrogen	A-11029
бычий сывороточный альбумин (BSA)	Santa Cruz	sc-2323
CuSO₄	Sigma	C-8027	растворить в H2O для приготовления стокового раствора 100 mM
DAPI	Sigma	D-9542	растворить в H2O для приготовления стокового раствора 5 mg/ml
DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Invitrogen	16000044
флуоресцентный азид (конъюгированный с Alexa Fluor 594)	Invitrogen	A10270
флуоресцентный азид (конъюгированный с Alexa Fluor 657)	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-аскорбиновая кислота	Sigma	A-5960	растворить в H2O до 500 mM
бумажный фильтр	VWRbrand	28333-087
параформальдегид	Sigma	158127
пенициллин-стрептомицин	Invitrogen	15140122
поли-L-лизин (MW ≥ 70000)	Sigma	P1274
Triton X-100	Sigma	T-8787
основание Trizma	Sigma	T-1503	растворить в H2O для приготовления стокового раствора 1.5 M, pH 8.5
трипсин-EDTA	Invitrogen	25200056
флуоресцентный микроскоп			напр. Olympus IX71
проточный цитометр			напр. BD Biosciences LSRII Fortessa