Производство ретровируса 1.1. Высейте суспензию одиночных клеток Bosc23 (6 × 10⁶) в чашку Петри диаметром 16 см и культивируйте в 18 мл среды DMEM (модифицированная иглами среда Дульбекко), содержащей 10% FBS (фетальная бычья сыворотка), до достижения конфлюэнтности культуры 80% (24 ч). ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны расти монослоем и не образовывать агрегатов в культуре. Подсчет клеток можно проводить различными методами (применимо для всех остальных представленных здесь протоколов). При небольшом количестве образцов рекомендуется ручной подсчет под микроскопом с использованием камеры Бюркера. В этом случае используйте трипановый синий для исключения мертвых клеток. Смешайте клетки в соотношении 1:1 с 0,4% раствором трипанового синего в PBS (фосфатно-солевом буфере). Для подсчета большого количества образцов можно использовать автоматический счетчик клеток. 1.2. Соедините 40 мкг ретровирусной конструкции (например, MSCV), 20 мкг pCL-Eco (упаковочный вектор), 80 мкл PEI (полиэтиленимина) и 2 мл среды с пониженным содержанием сыворотки (например, Opti-MEM (минимальная эссенциальная среда)) без антибиотиков. Инкубируйте эту смесь в течение 20 мин при комнатной температуре (RT). 1.3. Осторожно замените среду клеток Bosc23 на 16 мл DMEM с добавлением 2% FBS. Перед использованием подогрейте среду до 37 °C. ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте антибиотики во время трансфекции, так как они могут снизить эффективность трансфекции. 1.4. По каплям и осторожно добавьте смесь, приготовленную в пункте 1.2, в культуру Bosc23 и инкубируйте в течение 4 ч при 37 °C. Ограничьте время инкубации до 6 ч из-за токсичности PEI. 1.5. После инкубации замените среду Bosc23 на 18 мл подогретой DMEM, содержащей 10% FBS, и культивируйте клетки в течение 48 ч при 37 °C. Поместите чашки в лабораторию 2-го уровня биобезопасности и соблюдайте стандартные процедуры безопасности. 1.6. Соберите среду Bosc23 (содержащую экотропные ретровирусные частицы) с помощью серологической пипетки объемом 25 мл в коническую пробирку объемом 50 мл и храните при 4 °C. ПРИМЕЧАНИЕ: (Важно) Эффективность трансфекции должна достигать 90% для получения вируса с высоким титром. 1.7. Добавьте к клеткам Bosc23 18 мл подогретой DMEM с 10% FBS и культивируйте в течение 24 ч. 1.8. Повторите шаг 1.6. ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатанты ретровируса из шагов 1.6 и 1.8 можно объединить после того, как они достигнут одной температуры (4 °C), чтобы сохранить целостность вируса. 1.9. Чтобы избежать загрязнения супернатантов вируса клетками Bosc23, центрифугируйте собранный вирус при 1500 × g в течение 10 мин при 4 °C. Разделите вирус на аликвоты, мгновенно заморозьте с помощью сухого льда или жидкого азота и храните при -80 °C. Однако обратите внимание, что свежеприготовленный вирус обладает более высокой эффективностью инфицирования, чем замороженные стоки. ПРИМЕЧАНИЕ: (Важно) Избегайте повторного замораживания и размораживания вируса, так как это приводит к его деградации. Зябловская, П., и др.л., Пролиферация и дифференцировка предшественников миелоидных клеток мыши 32D/G-CSF-R. J. Vis. Exp. (2018)
В данном видео продемонстрировано получение рекомбинантных ретровирусных частиц путем трансфекции упаковочных клеток, полученных из почек человека, что позволяет осуществлять стабильную доставку генов в целевые клетки для последующего применения, такого как генетическая модификация, функциональные анализы или исследования дифференцировки клеточных линий.
