Создание рекомбинантного респираторно-синцитиального вируса с GFP-меткой с использованием системы экспрессии T7

Аннотация

1. Восстановление и первый пассаж рекомбинантного вируса ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие этапы следует проводить в стерильных условиях, используя шкаф биологической безопасности II класса. За день до трансфекции приготовьте суспензию клеточной линии BSRT7/5 в концентрации 5 x 10⁵ клеток/мл в полной среде. Распределите по 2 мл клеточной суспензии в каждую лунку планшета на 6 лунок. Подготовьте по одной лунке для каждого восстанавливаемого вируса и одну дополнительную лунку для отрицательного контроля. Инкубируйте планшет при 37 °C и 5% CO₂. На следующий день убедитесь, что конфлюэнтность клеток составляет 80%–90%. Разморозьте векторы респираторно-синцитиального вируса (RSV) для обратной генетики p-RSV-GFP и p-RSV-M2-1-GFP, а также p-N, p-P, p-L и p-M2-1. Для каждого восстанавливаемого вируса смешайте в пробирке 1 мкг p-N и p-P, 0,5 мкг p-L, 0,25 мкг p-M2-1 и 1,25 мкг p-RSV (GFP или M2-1 GFP). ПРИМЕЧАНИЕ: Могут быть использованы другие экспрессионные векторы для вирусных белков полимеразного комплекса (N, P, L и M2-1), однако необходимо соблюдать соотношение между белками. Отрицательный контроль проводится путем замены вектора p-RSV пустым вектором. Перейдите к трансфекции (см. Таблицу материалов). Добавьте 250 мкл среды с пониженным содержанием сыворотки к смеси векторов. В другой пробирке разведите 10 мкл реагента для трансфекции в 250 мкл среды с пониженным содержанием сыворотки. Осторожно перемешайте обе пробирки на вортексе и подождите 5 мин. Смешайте содержимое обеих пробирок и выждите 20 мин при комнатной температуре. Промойте клетки BSRT7/5 1 мл среды с пониженным содержанием сыворотки и внесите по 1,5 мл минимальной эссенциальной среды (MEM) с 10% фетальной тельчей сыворотки (FCS) без антибиотиков в каждую лунку. При необходимости инкубируйте при 37 °C и 5% CO₂ до завершения инкубации, описанной в этапе 1.3.1. По истечении 20-минутной инкубации добавьте 500 мкл трансфекционной смеси, приготовленной на этапе 1.3.1, в лунку. Поместите клетки в инкубатор при 37 °C и 5% CO₂ на 3 дня. Не меняйте культуральную среду клеток в процессе трансфекции. Один раз в день контролируйте эффективность восстановления, наблюдая флуоресценцию зеленого флуоресцентного белка (GFP) (возбуждение при 488 нм и эмиссия при 515–535 нм) с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа при 20-кратном увеличении, используя GFP-фильтр. Буйе, С. и др.выделение, амплификация и титрование рекомбинантных респираторно-синцитиальных вирусов. J. Vis. Exp. (2019)

В данном видео демонстрируется создание рекомбинантного респираторно-синцитиального вируса, экспрессирующего зеленый флуоресцентный белок (GFP), с использованием системы обратной генетики на основе T7. Ко-трансфекция плазмид, кодирующих вирусные белки, и генома с меткой GFP приводит к экспрессии белков и инициирует восстановление вируса.

Протокол

1. Рекуперация и первый пассаж рекомбинантного вируса

ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие этапы следует выполнять в стерильных условиях, используя шкаф биологической безопасности II класса.

1. За день до трансфекции приготовьте суспензию клеточной линии BSRT7/5 в концентрации 5 x 10⁵ клеток/мл в полной среде. Разлейте по 2 мл суспензии клеток в каждую лунку планшета на 6 лунок. Подготовьте по одной лунке для каждого восстанавливаемого вируса и одну дополнительную лунку для отрицательного контроля. Инкубируйте планшет при 37 °C и 5% CO₂. На следующий день убедитесь, что клетки достигли конфлюэнтности 80%–90%.
2. Разморозьте векторы для обратной генетики респираторно-синцитиального вируса (RSV) p-RSV-GFP и p-RSV-M2-1-GFP, а также p-N, p-P, p-L и p-M2-1. Для каждого восстанавливаемого вируса смешайте в пробирке 1 µg p-N и p-P, 0,5 µg p-L, 0,25 µg p-M2-1 и 1,25 µg p-RSV (GFP или M2-1 GFP).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Могут быть использованы другие экспрессионные векторы для вирусных белков полимеразного комплекса (N, P, L и M2-1), однако необходимо поддерживать соотношение между белками. Для проведения отрицательного контроля замените вектор p-RSV пустым вектором.
3. Перейдите к трансфекции (см. таблицу материалов).
   1. Добавьте 250 µL среды с пониженным содержанием сыворотки к смеси векторов. В другой пробирке разведите 10 µL реагента для трансфекции в 250 µL среды с пониженным содержанием сыворотки. Осторожно перемешайте обе пробирки на вортексе и выждите 5 мин. Смешайте содержимое обеих пробирок и выждите 20 мин при комнатной температуре.
   2. Промойте клетки BSRT7/5 1 мл среды с пониженным содержанием сыворотки и разлейте по лункам по 1,5 мл минимальной эссенциальной среды (MEM) с 10% фетальной телячьей сывороткой (FCS) без антибиотиков. При необходимости инкубируйте при 37 °C и 5% CO₂ до завершения инкубации, описанной в шаге 1.3.1.
   3. По истечении 20-минутного времени инкубации добавьте 500 µL смеси для трансфекции, приготовленной в шаге 1.3.1, в лунку. Поместите клетки в инкубатор при 37 °C и 5% CO₂ на 3 дня. Не меняйте культуральную среду клеток во время трансфекции.
4. Для мониторинга эффективности восстановления один раз в день наблюдайте за флуоресценцией зеленого флуоресцентного белка (GFP) (возбуждение при 488 nm и эмиссия при 515–535 nm) с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа с 20-кратным увеличением, используя GFP-фильтр.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
BSRT7/5		недоступно для коммерческого приобретения	См. ссылку 22. Buchholz et al. 1999
Флуоресцентный микроскоп для наблюдений	Olympus	IX73 Olympus microscope
Флуоресцентный микроскоп для видеомикроскопии	Olympus	ScanR Olympus microscope
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
HEPES ≥99.5%	Sigma	H3375
L-глутамин (200 mM)	ThermoFisher Scientific	25030024
Реагент Lipofactamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668019	Протокол в пункте 2.3 оптимизирован для данного реагента.
MEM (10x), без глутамина	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, добавка GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5%	Sigma	M7506
Среда с пониженным содержанием сыворотки Opti-MEM I	ThermoFisher Scientific	51985-026
Плазмиды		недоступно для коммерческого приобретения	См. ссылку 21. Rameix-Welti et al. 2014