Метод определения титра вируса по количеству бляшек для количественной оценки инфекционного респираторно-синцитиального вируса

Аннотация

Источник: Буйе, С., и др. Получение, амплификация и титрование рекомбинантных респираторно-синцитиальных вирусов. J. Vis. Exp. (2019)

В видео демонстрируется метод титрования по бляшкам, используемый для количественного определения инфекционного рекомбинантного респираторно-синцитиального вируса (RSV) в монослоях эпителиальных клеток. В нем показано заражение клеток-хозяев серийно разведенными вирусными суспензиями, ограничение распространения вируса с помощью полутвердого агарозного слоя на основе целлюлозы и формирование локализованных бляшек вследствие цитопатического действия. Процедура завершается окрашиванием, деконтаминацией и подсчетом бляшек для определения титра вируса и оценки инфекционности RSV.

Протокол

1. Метод определения титра путем подсчета бляшек

1. Подготовьте 12-луночные планшеты для титрования за день до проведения анализа (для титрования одной пробирки с вирусом потребуется шесть лунок). Рассейте в лунки клетки эпителия человека типа 2 (HEp-2) в объеме 1 мл с концентрацией 5 × 10⁵ клеток/мл в полной среде.
2. На следующий день приготовьте стерильную суспензию микрокристаллической целлюлозы (2,4% [масс./об.] в воде) (см. таблицу материалов).
   1. Рассредоточьте 2,4 г порошка микрокристаллической целлюлозы в 100 мл дистиллированной воды с помощью стандартной магнитной мешалки до полного растворения порошка (обычно 4–12 ч). Автоклавируйте суспензию при 121 °C в течение 20 мин, после чего хранить при комнатной температуре до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При таких условиях суспензия стабильна в течение 1 года.
   2. После вскрытия флакона в стерильных условиях храните раствор при 4 °C в течение 6 месяцев. Перед использованием всегда перемешивайте суспензию (встряхиванием вручную или на вортексе), чтобы обеспечить ее гомогенность.
3. Приготовьте 2× минимальная эссенциальная среда (MEM) в стерильных условиях. Разбавьте коммерческую среду MEM 10× стерильной водой и добавьте L-глутамин, пенициллин в концентрации 1000 ед/мл и стрептомицин в концентрации 1 мг/мл. Тщательно перемешайте разведение и храните его при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 1.4–1.10 в стерильных условиях, используя шкаф биологической безопасности II класса.
4. Подготовьте шесть пробирок, содержащих 900 µL среды MEM без фетальной телячьей сыворотки (ФТС) на каждый образец вируса, подлежащий титрованию (пробирки для титрования). Разморозьте аликвоты вируса, интенсивно перемешайте их на вортексе в течение 5 с и перенесите 100 µL в первую пробирку для титрования.
5. Выполните десятикратное разведение 6×, следующим образом. Добавьте 100 μL вируса в 900 μL среды в первую пробирку, закройте пробирку крышкой и перемешайте содержимое с помощью вортекса в течение нескольких секунд. Смените наконечник пипетки, добавьте 100 µL первого разведения до 900 µL добавьте среду во вторую пробирку, закройте ее крышкой и перемешайте на вортексе. Повторите процедуру до шестой пробирки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно менять наконечник для каждого разведения.
6. На 12-луночных планшетах с клетками HEp-2 укажите название вируса и кратность разведений. Поставьте метку, чтобы соотнести планшет с его крышкой, так как при окрашивании (шаг 1.9) они могут быть разделены. Удалите из планшетов среду и распределите 400 µL по одному разведению на лунку. Инкубируйте планшеты при 37 °C в течение 2 ч для адсорбции вируса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Меняйте наконечник пипетки после каждого инокулята или используйте один и тот же наконечник, двигаясь от наименьшей к наибольшей концентрации. Инкулируйте ограниченное количество планшетов (1–2) одновременно, чтобы избежать высыхания клеток.
7. Приготовьте слой из микрокристаллической целлюлозы во время адсорбции вируса (экстемпоральное приготовление). Чтобы получить 100 мл слоя, смешайте 10 мл 2,4% суспензии микрокристаллической целлюлозы, 10 мл 2× MEM и 80 мл MEM с 2% FCS.
   1. Доведите pH 2-× Доведите pH среды MEM примерно до 7,2 с помощью стерильного 7,5% раствора гидрокарбоната натрия, ориентируясь по цветовому индикатору. Добавьте суспензию микрокристаллической целлюлозы и среду MEM, после чего тщательно перемешайте.
8. По окончании 2-часовой инкубации добавьте в каждую лунку 12-луночного планшета от 2 до 3 мл полужидкого покрытия, не удаляя инокулят. Соблюдайте осторожность, чтобы избежать контаминации соседних лунок инокулятами с высоким титром вируса. Инкубируйте планшет при 37 °C и 5% CO2₂ в течение 6 дней. Во время инкубации не перемещайте планшет и не перемещайте инкубатор.
9. Перейдите к окрашиванию клеток, используя раствор кристаллического фиолетового (8% кристаллического фиолетового [об/об], 2% формальдегида [об/об] и 20% этанола [об/об] в воде).
   1. Застелите рабочую поверхность бокса биологической безопасности защитным листом (кристаллический фиолетовый сильно окрашивает поверхности).
   2. Осторожно встряхните планшеты, чтобы удалить слой микрокристаллической целлюлозы. Удалите супернатанты и промойте клетки 2× с 1× фосфатно-солевой буфер (PBS). Обрабатывайте планшеты по одному, чтобы предотвратить высыхание клеток. Добавьте 1–2 мл раствора кристаллического фиолетового и подождите 10–15 мин. Удалите раствор, который можно использовать повторно для окрашивания следующих планшетов.
   3. Погрузите планшеты и крышки в свежий раствор гипохлорита натрия на несколько секунд, после чего тщательно промойте их проточной водой. Обратите внимание, что деконтаминация планшетов и крышек осуществляется с помощью раствора гипохлорита натрия.
   4. Поместите планшеты и крышки на бумажные полотенца и дайте им высохнуть. После промывки водой сушите планшеты при температуре окружающей среды и храните их при комнатной температуре. При длительном хранении (в течение нескольких месяцев) держите планшеты в защищенном от света месте для сохранения интенсивности окраски. Обратите внимание, что если клетки обесцветятся, их можно повторно окрасить кристаллическим фиолетовым.
10. Рассчитайте титры вируса. Подсчитайте количество бляшек в лунках на сухих планшетах, которые видны невооруженным глазом. Убедитесь, что количество бляшек для различных разведений коррелирует между собой (различие в 10 раз между каждым разведением). Выберите лунку, в которой бляшки легче всего подсчитать. Определите количество бляшек относительно объема инокулята и степени разведения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На приведенном примере в Рисунок 1, подсчитано 21 бляшка при разведении 10^-5 разведение. Это соответствует титру

Результаты

Рисунок 1: Определение титра RSV с помощью метода бляшек. (A) Результаты анализа титрования бляшек в 12-луночном планшете. Показаны шесть лунок, инфицированных последовательными разведениями одного вирусного стока. Разведения указаны в десятичном логарифме. Клетки, инфицированные тремя первыми разведениями, полностью отслоились. Количество бляшек, наблюдаемое при разведениях 10^-4, 10^-5 и 10^-6, является стабильным. (B) Иллюстрация подсчета бляшек (желтые цифры). Зеленая звезда указывает на царапины на клеточном слое.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Раствор кристаллического фиолетового	Sigma	HT90132
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
MEM (10x), без глутамина	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, добавка GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	41090-028
Раствор бикарбоната натрия 7.5%	ThermoFisher Scientific	25080094
Пенициллин-стрептомицин (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122