Анализ обратной транскриптазы (ОТ) в супернатантах культур клеток Подготовьте бокс биологической безопасности в лаборатории уровня биобезопасности 3 (BSL-3) для работы с радиоактивными материалами. Поместите в бокс абсорбирующую бумагу и замените аспиратор на аспиратор, предназначенный для работы с радиоактивными веществами. ПРИМЕЧАНИЕ: Все радиоактивные отходы должны быть утилизированы надлежащим образом в соответствии с правилами техники безопасности. Добавьте 1–2 мкл [α-33P]дезокситимидинтрифосфата (dTTP) в концентрации 10 мКи/мл и 4 мкл 1 М дитиотреитола (ДТТ) в каждую аликвоту основной смеси для ОТ объемом 1 мл (см. таблицу 1). Осторожно перемешайте содержимое каждой микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 мл с основной смесью для ОТ, ДТТ и [α-33P]dTTP с помощью пипетки на 1000 мкл и перенесите в стерильный лоток. Разлейте по 25 мкл меченой смеси для ОТ в каждую лунку тонкостенного 96-луночного планшета для полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте место для положительного контроля (инфицирование диким типом (WT) MJ4) и отрицательного контроля (имитация инфицирования/mock-инфекция). Добавьте по 5 мкл каждого супернатанта в ПЦР-планшет, содержащий основную смесь для ОТ. Герметично закройте ПЦР-планшет адгезивной фольгой и инкубируйте в течение 2 ч при 37 °C в термоциклере. В целях безопасности промойте наконечники пипеток раствором Amphyl и утилизируйте их в небольшом контейнере с отходами Amphyl, который позже будет утилизирован как радиоактивные отходы. После инкубации сделайте небольшие отверстия в фольге с помощью 200-мкл многоканальной пипетки. ПРИМЕЧАНИЕ: Если наконечники пипетки коснулись жидкости в лунке, замените их перед переходом к следующему столбцу или ряду. Перемешайте образцы 5 раз и перенесите по 5 мкл каждого образца на бумагу DE-81. Высушите на воздухе в течение 10 мин. Промойте блоты 5 раз 1x салин-цитратом натрия (SSC), а затем 2 раза 90% этанолом (по 5 мин на каждую промывку). Высушите на воздухе. Поместите каждый блот в отдельный контейнер для промывки (например, в коробку для хранения сэндвичей), добавьте достаточное количество промывочного буфера (1x SSC или 90% этанола (EtOH)), чтобы покрыть блот, и встряхивайте в течение 5 мин. Слейте промывочный буфер в отдельный контейнер и повторите процедуру. ПРИМЕЧАНИЕ: Первые 3 промывки считаются радиоактивными и должны быть утилизированы надлежащим образом. Последние 2 промывки можно утилизировать обычным способом. После высыхания осторожно оберните блот пищевой пленкой Saran и экспонируйте на фосфорном экране в плотно закрытой кассете в течение ночи при комнатной температуре. Проанализируйте фосфорные экраны с помощью фосфоримаджера и количественно определите радиоактивные транскрипты. Обведите каждый радиоактивный сигнал кругом с помощью программного обеспечения OptiQuant. Постройте график значений цифровых единиц света (DLU) для создания кривых репликации. Для расчета показателей репликативной способности значения DLU были подвергнуты log10-преобразованию, а наклоны кривых были рассчитаны по временным точкам 2, 4 и 6 дней. Затем наклоны репликации делили на наклон для WT MJ4 для получения показателей репликативной способности. Важно проводить нормализацию на основе значений MJ4 WT, полученных с того же планшета для ОТ, чтобы снизить вариабельность внутри анализа. Таблица 1: Рецепт основной смеси для радиоизотопного анализа обратной транскриптазы. ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить в виде аликвот по 1 мл при -20 °C. Реагент | Объем (мл) --- | --- H2O, свободная от нуклеаз | 419,5 Tris-Cl, pH 7,8 (1 M) | 30 Хлорид калия (1 M) | 37,5 Хлорид магния (1 M) | 2,5 Nonidet P-40 (10%) | 5 ЭДТА (0,5 M) | 1,02 Полиадениловая кислота, калиевая соль (2 мг/мл) | 1,25 Oligo-dT праймер (25 мкг/мл) | 3,25 Общий объем | 500 Клейборн, Д. Т. и др. Метод клонирования на основе рестриктаз для оценки In vitro Репликационная способность химерных вирусов HIV-1 подтипа C Gag-MJ4. J. Vis. Exp. (2014)
В этом видео демонстрируется оценка способности вируса к репликации с помощью радиоактивного анализа обратной транскриптазы. Супернатанты культур, содержащие дочерние вирионы, добавляют в смесь для обратной транскрипции, содержащую радиоактивно меченный нуклеотид. Включенный сигнал отражает выход вируса и эффективность репликации. Для детектирования и сравнения сигналов между исследуемыми образцами и образцами дикого типа используется фосфоримиджинг.
