1. Подготовка образцов Получите образцы, содержащие вирус, экспрессирующий люциферазу (в качестве примера здесь используется VSV∆51-Fluc), для определения титра и переноса в 96-луночные планшеты. В качестве альтернативы можно проводить инфицирование в 96-луночных планшетах для культивирования тканей и использовать супернатанты напрямую. Оставьте два столбца необработанными для построения стандартных кривых. Для экспериментов, проводимых непосредственно в 96-луночных планшетах, определите титр в конце эксперимента (через 40 ч после инфицирования) или храните при -80 °C и определите титр позднее. 2. Подготовка восприимчивых клеток для определения титра вируса За 24 ч до определения титра подготовьте суспензию клеток Vero в концентрации 2,5 x 10⁵ клеток/мл в модифицированной среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 30 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновой кислоты (HEPES) и 1% пенициллина/стрептомицина. ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя в данном протоколе используются клетки Vero, может быть использована любая подходящая восприимчивая клеточная линия для инфицирования вирусом везикулярного стоматита (VSV). С помощью диспенсера для микропланшетов внесите 2,5 x 10⁴ клеток (100 мкл) в белые непрозрачные 96-луночные планшеты с плоским дном. Подготовьте 12 мл клеточной суспензии на один планшет плюс 5 мл для заполнения системы. Очистите кассету диспенсера, промыв трубки 50 мл стерильной воды. Заполните линии диспенсера клеточной суспензией и пропустите через систему 5 мл суспензии. Выберите программу для раздачи 100 мкл в каждую лунку белого 96-луночного планшета. Выполните разлив, при необходимости повторите для дополнительных планшетов. Также засейте несколько лунок в прозрачном 96-луночном планшете с плоским дном, если используются белые планшеты с непрозрачным дном, для проверки жизнеспособности и плотности клеток. По завершении верните остатки клеток в исходный контейнер. Очистите кассету, пропустив через трубки 50 мл 70% этанола, а затем 50 мл теплой стерильной воды. Убедитесь, что кассета и трубки надлежащим образом очищены между использованиями. Инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂. 3. Подготовка стандартной кривой вируса Подготовьте стандартную кривую VSV∆51-Fluc в среде DMEM без сыворотки таким образом, чтобы конечная концентрация бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мл после переноса на клетки Vero была следующей: 10⁸ БОЕ/мл, 10⁷ БОЕ/мл, 10⁶ БОЕ/мл, 10⁵ БОЕ/мл, 10⁴ БОЕ/мл, 10³ БОЕ/мл, 10² БОЕ/мл и 10¹ БОЕ/мл. Подготовьте по 50 мкл каждой концентрации на один планшет с клетками Vero плюс дополнительно 10%. ПРИМЕЧАНИЕ: Титр стокового раствора вируса с люциферазой необходимо определить классическим способом для построения стандартной кривой, которая позволит провести абсолютное количественное определение. В противном случае можно достичь относительного количественного определения без точных данных о титре, произвольно назначив титр вируса на основе этапов разведения. Например, первое разведение стандартной кривой может быть принято за 10⁸ вирусных единиц, следующее разведение 1/10 — за 10⁷ и так далее. В этом случае значения следует выражать как кратность изменения по сравнению с заранее определенным образцом, так как абсолютное количественное определение будет неточным. 4. Перенос супернатантов образцов на восприимчивые клетки Осмотрите клетки Vero в прозрачном 96-луночном планшете под световым микроскопом, чтобы подтвердить, что монослои слились не менее чем на 95%. Перенесите 25 мкл супернатанта образца на клетки Vero, засеянные в белые планшеты. Не переносите супернатанты в два столбца, предназначенных для стандартных кривых. ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать одновременно для всех лунок одного планшета с помощью 96-канального автоматического дозатора. Используя 8- или 12-канальный многоканальный пипеттор, добавьте по 25 мкл каждого разведения стандартной кривой, приготовленной на этапе 3, к клеткам Vero в два предназначенных столбца. Центрифугируйте планшеты в течение 5 мин при 430 x g при комнатной температуре (RT). Инкубируйте в течение 5 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂. Garcia, V., и др.Высокопроизводительное титрование рекомбинантных вирусов, экспрессирующих люциферазу. J. Vis. Exp. (91), e51890, doi:10.3791/51890 (2014).
В данном видео демонстрируется подготовка образцов клеточных культур для оценки вирусной нагрузки с помощью анализа на основе люциферазы. В нем описывается процесс инфицирования эпителиальных клеток генетически модифицированным вирусом, перенос вирусных супернатантов и стандартов в лунки для анализа, а также стимуляция проникновения вируса путем центрифугирования и инкубации. Экспрессия люциферазы служит репортером, позволяющим количественно определить концентрацию вируса на основании интенсивности люминесцентного сигнала.
