Инфицирование эмбриональных стволовых клеток мыши (мЭСК) лентивирусом. Культивируйте адаптированные к бесфидерному росту мЭСК для анализа хроматина in vivo (CiA) с низким числом пассажей (менее 35-го пассажа) в базовой среде DMEM (модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко) с высоким содержанием глюкозы, дополненной 20% фетальной бычьей сывороткой (FBS) степени чистоты для ЭСК, 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновой кислоты (HEPES), 1х смесью незаменимых аминокислот (NEAA), пенициллином/стрептомицином, 2-меркаптоэтанолом и лейкозным ингибирующим фактором (LIF) в соотношении 1:500 в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2. ПРИМЕЧАНИЕ: LIF получают из супернатанта клеток Cos, продуцирующих Lif-1C-alpha (COS LIF), которые собирают партиями и замораживают при -80 °C. Выращивайте клетки на планшетах, предварительно инкубированных в течение 1–3 ч с 0,1% желатином в 1х фосфатно-солевом буфере (PBS), с последующим промыванием 1х PBS. Подкармливайте клетки ежедневно и пересевайте каждые 2–3 дня в зависимости от их плотности. ПРИМЕЧАНИЕ: Морфологически колонии эмбриональных стволовых (ЭС) клеток должны быть маленькими, круглыми и четко отделенными друг от друга. За сутки до инфицирования перенесите мЭСК в 12-луночный планшет (100 000 клеток на лунку). Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра. Для клеток, выращенных в чашках диаметром 10 см, удалите старую среду, добавьте 5 мл 1х PBS, удалите PBS и добавьте 1 мл 0,25% трипсина. Инкубируйте клетки в трипсине в течение 8 мин при 37 °C, встряхивая и постукивая по чашке в середине инкубационного периода. Цель этого этапа — получить суспензию из отдельных клеток. Через 48 ч после смены среды в клетках эмбриональной почки человека 293T (HEK), выращенных в 15-см чашках, удалите супернатант и перенесите его в коническую пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте супернатант при 300 x g в течение 5 мин для осаждения клеточного дебриса. Профильтруйте супернатант через мембрану с порами 0,45 мкм. ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно используйте мембраны из ацетата целлюлозы без ПАВ (SFCA), так как другие материалы могут удерживать вирус и значительно снизить выход. Концентрируйте вирус методом ультрацентрифугирования, используя центрифугу с ротором SW32, при 20 000 об/мин (~72 000 x g) в течение 2,5 ч при 4 °C. Пока вирус концентрируется в ультрацентрифуге, обработайте CiA мЭСК в 12-луночном планшете свежей средой для ЭСК, содержащей 5 мкг/мл полибрена. По завершении концентрирования вируса осторожно удалите супернатант и ресуспендируйте вирусный осадок в 100 мкл 1х PBS (избегайте образования избыточных пузырьков). Перенесите вирус и 1х PBS в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Перемешайте содержимое пробирки на вортексе или встряхиванием при 300 x g (или на минимальном режиме), чтобы полностью ресуспендировать вирус. Центрифугируйте пробирку в мини-настольной центрифуге в течение 5–10 с для удаления пузырьков. Добавьте по 30 мкл вируса в каждую лунку 12-луночного планшета. Повращайте планшет, затем центрифугируйте его при 1 000 x g в течение 20 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Количество добавляемого вируса может варьироваться в зависимости от вирусного титра, который обратно пропорционален размеру конструкции доставки. В качестве альтернативы вирус можно подвергнуть шоковой заморозке в жидком азоте и хранить при -80 °C. Однако замораживание снижает вирусный титр. Верните 12-луночный планшет в инкубатор при 37 °C и замените среду на следующее утро (~через 16 ч) на свежую среду для ЭСК. Через 48 ч после инфицирования проведите селекцию клеток, в которые был интегрирован вирусный плазмид, добавив соответствующий антибиотик (например, пуромицин 1,5 мкг/мл,бластицидин 10 мкг/мл и т. д.). Меняйте среду ежедневно и промывайте клетки 1х PBS, если большинство клеток плавают или погибли. Инкубируйте клетки в селективной среде в течение 72–96 ч в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2. Кьярелла, А. М. и др. Подавление транскрипции генов путем перенаправления клеточного аппарата с помощью химических эпигенетических модификаторов. J. Vis. Exp. (2018)
В данном видео демонстрируется получение генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток мыши с помощью лентивирусной трансдукции. Лентивирусные частицы доставляют маркер устойчивости к антибиотику, что обеспечивает стабильную интеграцию в геном и возможность селекции трансдуцированных клеток.
