Идентификация клеток, инфицированных рекомбинантным вирусом вакцинии, с помощью метаболического и флуоресцентного селективного отбора

Аннотация

Создание рекомбинантного вируса Согласно Рисунку 1, инфицируйте монослой клеток BS-C-1 [Buffalo Subclone C-1 (линия эпителиальных клеток почки обезьяны, производная от клеток CV-1)] вирусом вакцинии в безсывороточной среде при множественности заражения (MOI) > 1. Через 1 час после инфицирования замените среду на модифицированную среду Игла в модификации Дульбекко (DMEM) и проведите трансфекцию смесью плазмиды-вектора рекомбинации и реагента для трансфекции в соотношении 3:1 в безсывороточной среде. Через 24 часа соскребите и соберите клетки в среду DMEM без добавления фетальной бычьей сыворотки (FBS), затем проведите три цикла замораживания-оттаивания для разрушения клеток и высвобождения вирусных частиц. Проведите анализ по методу образования бляшек с использованием жидкого слоя 10% FBS DMEM и реагентов для селекции GPT (гуанинфосфорибозилтрансфераза из E. coli): микофеноловой кислоты (25 мкг/мл) и ксантина (250 мкг/мл) следующим образом: 1. Высейте в 6-луночный планшет монослой клеток BS-C-1. 2. Инфицируйте 100% конфлюэнтные монослои клеток серийными разведениями замороженно-оттаявших клеток, содержащих вирусные частицы, чтобы обеспечить достаточное разделение отдельных бляшек. 3. Покройте жидким слоем среды DMEM с 10% FBS, содержащей селективные реагенты GPT — микофеноловую кислоту и ксантин в конечных концентрациях 25 мкг/мл и 250 мкг/мл соответственно. После 24-часовой инкубации удалите жидкий слой и с помощью флуоресцентного микроскопа найдите бляшки с диффузной красной флуоресценцией, что соответствует встраиванию mCherry из вектора TDS (транзиентной доминантной селекции) в вирус. В зависимости от целевого гена и выбранного флуоресцентного маркера в той же красной бляшке может наблюдаться локализованная флуоресценция маркированного гена. Соберите несколько бляшек для каждого рекомбинантного вируса путем локального соскребания наконечником пипетки в 100 мкл среды DMEM с 5% FBS, перенесите клетки в пробирку Eppendorf, после чего проведите три цикла замораживания-оттаивания соскребленных клеток для высвобождения рекомбинантных вирусов. Добавьте DMEM с замороженно-оттаявшим вирусом к монослою клеток в 12-луночном планшете для амплификации рекомбинантных вирусов с использованием реагентов селекции GPT в ростовой среде. Соскребите успешно амплифицированные клетки через 24 часа после инфицирования. Проведите анализ по методу образования бляшек для успешно амплифицированных бляшек с красной флуоресценцией, на этот раз с использованием агарозного слоя и селекции GPT следующим образом: 1. Высейте в 6-луночный планшет монослой клеток BS-C-1. 2. Выполните серийное разведение рекомбинантных вирусов и инфицируйте лунки возрастающими разведениями вирусов в среде DMEM без FBS. 3. Через 1 час после инфицирования удалите жидкую среду и покройте каждую лунку 0,5% агарозой в минимальной эссенциальной среде (MEM), содержащей 2,5% FBS, 292 мкг/мл L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, вместе с реагентами селекции GPT. Через 2-3 дня после инфицирования выберите бляшки, проявляющие как красную флуоресценцию, так и флуоресценцию выбранного маркера, для повторной амплификации, на этот раз без селекции GPT. Проведите следующий анализ по методу образования бляшек с агарозным слоем без селекции. Выберите бляшки, которые утратили диффузную красную флуоресценцию, но сохранили локализованную флуоресценцию выбранного маркера. Продолжайте очистку бляшек без селекции до получения чистого стока рекомбинантных вирусов, которые утратили гены mCherry и gpt, но сохранили локализованную флуоресценцию выбранного маркера. Проверьте чистоту стоков методом анализа бляшек; все бляшки должны иметь схожий фенотип. Марзук, Н. Б., и др., Методика эффективного получения белков вируса вакцины с флуоресцентными метками. J. Vis. Exp. (2014)

В данном видео демонстрируется получение рекомбинантных вирусов вакцинии с использованием плазмидной гомологичной рекомбинации в инфицированных эпителиальных клетках. Флуоресцентные и метаболические маркеры позволяют проводить селекцию и идентификацию вирусов, экспрессирующих меченые белки.

Протокол

Получение рекомбинантного вируса

1. Согласно Рисунку 1, инфицируйте монослой клеток BS-C-1 [Buffalo Subclone C-1 (линия эпителиальных клеток почки обезьяны, полученная из клеток CV-1)] вирусом вакцины в безсывороточной среде с множественностью заражения (MOI) > 1.
2. Через 1 ч после инфицирования замените среду на модифицированную среду Игла в модификации Дульбекко (DMEM) и проведите трансфекцию смесью плазмиды вектора рекомбинации и реагента для трансфекции в соотношении 3:1 в безсывороточной среде.
3. Через 24 ч снимите клетки с поверхности путем скребка и соберите их в DMEM без фетальной бычьей сыворотки (FBS), затем проведите три цикла замораживания-оттаивания для разрушения клеток и высвобождения вирусных частиц.
4. Проведите анализ бляшек с жидким покрытием из DMEM с 10% FBS и реагентами для селекции по GPT (гуанинфосфорибозилтрансферазе (E. coli)): микофеноловой кислотой (25 µg/ml) и ксантином (250 µg/ml) следующим образом:
   1. Засейте 6-луночный планшет монослоем клеток BS-C-1.
   2. Инфицируйте 100% конфлюэнтные монослои клеток серийными разведениями замороженных и оттаявших клеток, содержащих вирусные частицы, чтобы обеспечить достаточное разделение отдельных бляшек.
   3. Покройте жидкой средой DMEM с 10% FBS, содержащей реагенты для селекции по GPT — микофеноловую кислоту и ксантин в конечных концентрациях 25 µg/ml и 250 µg/ml соответственно.
5. После инкубации в течение 24 ч удалите жидкое покрытие и с помощью флуоресцентного микроскопа найдите бляшки с диффузной красной флуоресценцией, соответствующей встраиванию mCherry из вектора TDS (транзиторной доминантной селекции) в вирус. В зависимости от целевого гена и выбранного флуоресцентного маркера в той же красной бляшке может наблюдаться локализованная флуоресценция меченого гена.
6. Отоберите несколько бляшек для каждого рекомбинантного вируса путем локального скребка кончиком пипетки в 100 µl DMEM с 5% FBS, перенесите клетки в пробирку Eppendorf, после чего проведите три цикла замораживания-оттаивания собранных клеток для высвобождения рекомбинантных вирусов.
7. Добавьте DMEM с замороженным и оттаявшим вирусом к монослою клеток в 12-луночном планшете для амплификации рекомбинантных вирусов с использованием реагентов для селекции по GPT в ростовой среде. Снимите успешно амплифицированные культуры через 24 ч после инфицирования.
8. Проведите анализ бляшек для успешно амплифицированных бляшек с красной флуоресценцией, на этот раз с использованием агарозного покрытия и селекции по GPT следующим образом:
   1. Засейте 6-луночный планшет монослоем клеток BS-C-1.
   2. Проведите серийное разведение рекомбинантных вирусов и инфицируйте лунки возрастающими разведениями вирусов в DMEM без FBS.
   3. Через 1 ч после инфицирования удалите жидкую среду и залейте каждую лунку 0,5% агарозой в минимальной эссенциальной среде (MEM), содержащей 2,5% FBS, 292 µg/ml L-глутамина, 100 U/ml пенициллина и 100 µg/ml стрептомицина, вместе с реагентами для селекции по GPT.
9. Через 2-3 дня после инфицирования выберите бляшки, демонстрирующие как красную флуоресценцию, так и флуоресценцию цвета выбранного маркера, для повторной амплификации, на этот раз без селекции по GPT.
10. Проведите следующий анализ бляшек с агарозным покрытием без селекции.
11. Отоберите бляшки, которые утратили диффузную красную флуоресценцию, но сохранили локализованную флуоресценцию, соответствующую выбранному маркеру.
12. Продолжайте очистку бляшек без селекции до получения чистого стока рекомбинантных вирусов, утративших гены селекции mCherry и gpt, но сохранивших локализованную флуоресценцию выбранного маркера. Проверьте чистоту стоков методом анализа бляшек; все бляшки должны иметь схожий фенотип.

Результаты

Рисунок 1. Схема экспериментальной процедуры по созданию рекомбинантного вируса вакцины. Изображены события, происходящие на генетическом и клеточном уровнях, а также репрезентативные изображения бляшек, иллюстрирующие этапы после создания флуоресцентного вируса вакцины с меткой A3-GFP. (A) Клетки, инфицированные вирусом вакцины, трансфицируют рекомбинационным вектором TDS. (B) На этом рисунке показан только результат левосторонней рекомбинации; в качестве выбранного флуоресцентного маркера используется GFP. При правосторонней рекомбинации вся плазмида TDS была бы интегрирована в геном аналогичным образом, за исключением того, что на промежуточном этапе, т. е. на этапе C, маркер был бы слит со всем целевым геном. На монослое клеток проводят анализ бляшек с использованием смеси для рекомбинации и осуществляют селекцию с помощью GPT. (C) Бляшки, демонстрирующие как красную, так и зеленую флуоресценцию, соответствующую экспрессии mCherry и GFP соответственно, отбирают и амплифицируют. После снятия селекции происходит исчезновение красной флуоресценции, что соответствует потере генов gpt и mCherry (D), после чего отбирают и амплифицируют бляшки, демонстрирующие исключительно зеленую флуоресценцию (E).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микофеноловая кислота	Sigma-Aldrich	M3536-50MG	Растворить в 0.1 N NaOH
Ксантин	Sigma-Aldrich	X0626-5G	Растворить в 0.1 N NaoH
Реагент для трансфекции FuGENE HD	Promega	E2311
Флуоресцентный микроскоп, оснащенный фильтрами Chroma 31001, 31002	Olympus, Chroma	BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)