- Аденовирусная трансдукция и нокдаун эндогенного белка с помощью трансфекции малыми интерферирующими РНК (siRNA) в клетках HeLa-RFP-H2B с использованием осадка фосфата кальция (CaPi)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения минимальной множественности заражения (MOI) во всех процедурах аденофекции (10-20 бляшкообразующих единиц (PFU)/клетку) используется контрольный аденовирус, несущий несвязанный ген (т. е. LacZ) или не несущий никакого гена, при применении минимального количества рекомбинантного аденовируса, несущего интересующий ген.
ПРИМЕЧАНИЕ: Было показано, что данная процедура помогает нормализовать экспрессию на одну клетку в большой популяции клеток.
- Через один день после посева клеток подсчитайте количество клеток в дополнительной чашке. Отсосите среду и один раз промойте клетки 1 mL 0,05% раствора трипсина/этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA). Снова добавьте 1 mL 0,05% Trypsin/EDTA и инкубируйте при 37 °C, 5% CO₂ до полного открепления клеток. Тщательно ресуспендируйте клетки с помощью пипетки объемом 1 mL и подсчитайте количество клеток в 1 mL с использованием гемоцитометра.
- Определите количество вируса, необходимое для трансдукции клеток с множественностью заражения (MOI) 2 PFU на клетку для целевого белка (POI) и 18 PFU на клетку для пустого вектора (например, LacZ), чтобы общая доза составила 20 PFU на клетку. Одновременно трансдуцируйте по 4 PFU каждого бакуловируса, кодирующего актин с меткой зеленого флуоресцентного белка (GFP) и α-тубулин с меткой красного флуоресцентного белка (RFP). Проведите трансдукцию клеток согласно следующему протоколу аденофекции.
- В стерильном боксе подготовьте пластиковые пробирки объемом 1,5 mL для каждого условия и добавьте в каждую 400 μL подогретой альфа-минимумальной эфирной среды (αMEM).
- Медленно разморозьте аликвоты вирусов на льду и, при необходимости, разведите сток вируса, чтобы объем переносимой порции превышал 1 μL для минимизации ошибок пипетирования.
- Добавьте расчетное количество вируса для каждого условия в соответствующие пластиковые пробирки объемом 1,5 mL, содержащие 400 μL αMEM, и осторожно перемешайте пипетированием. Немедленно верните сток вируса при -80 °C для сохранения его активности.
- Отсосите среду из чашек с клетками и осторожно внесите вирусную смесь по каплям. Инкубируйте клетки при 37 °C, 5% CO₂ и осторожно встряхивайте чашки в стерильном боксе каждые 15 мин в течение 1 ч, чтобы обеспечить полное покрытие клеток вирусом. Использование малого объема среды способствует более тесному контакту вируса с клетками.
- После инкубации осторожно добавьте по 1,6 mL αMEM в каждую чашку до достижения общего объема 2 mL, начните синхронизацию клеток, добавив 2 mM тимидина, и инкубируйте клетки еще 2 ч при 37 °C, 5% CO₂.
- Тем временем подготовьте смесь для трансфекции siRNA методом CaPi (см. Рисунок 1). Если siRNA не требуется, замените ее объем стерильной водой для проведения холостой трансфекции.
- Рассчитайте 200 μL смеси для каждого условия, что в сумме составит 400 μL на дубликат. Ниже приведен пример для конечной концентрации siRNA 50 nM, который необходимо адаптировать для каждого конкретного целевого белка. В пластиковую пробирку объемом 1,5 mL внесите 50 μL 1 M CaCl2 и 11 μL 20 μM siRNA в 139 μL стерильной H2O и перемешайте на вортексе. После кратковременного центрифугирования осторожно и по каплям добавьте 200 μL 2× HEPES-солевого буфера (HBS2x) (280 mM NaCl, 50 mM 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES), 1.5 mM Na₂HPO₄, pH 7.01-7.05).
ПРИМЕЧАНИЕ: Чем меньше капли, тем мельче осадок, что приводит к более высокой эффективности трансфекции. Осторожно перемешайте смесь трижды путем вдувания воздуха с помощью пипетки на 200 μL. - Инкубируйте смесь в течение 30 мин при комнатной температуре (RT). Медленно добавьте по 200 μL трансфекционной смеси в каждую чашку и перемешайте крестообразными движениями. Перенесите чашки в инкубатор при 37 °C, 5% CO₂ на 16 ч.
- На следующий день дважды промойте клетки 2 mL подогретого HEPES (6.7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7.3) и добавьте 2 mL αMEM. Не обрабатывайте более четырех чашек с клетками одновременно, так как колебания температуры влияют на продолжительность клеточного цикла.
- Оцените эффективность инфицирования с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа при увеличении 20-40x (объектив) и сделайте по три репрезентативных изображения для каждого условия как в флуоресцентном, так и в трансмиссионном каналах для документации. Через семь часов добавьте 2 mM тимидина и инкубируйте еще 16 ч при 37 °C, 5% CO₂.
- На следующий день, через 48 ч после трансфекции siRNA и инфекции вирусом, дважды промойте клетки 2 mL подогретого фосфатно-солевого буфера (PBS) и оставьте на 7 ч в 2 mL αMEM без фенолового красного (для прижизненной визуализации клеток) или с феноловым красным (для экстракции белков).
- Соберите клетки для каждого условия через 48 ч после трансфекции для подготовки белковых экстрактов и проведения вестерн-блот анализа с целью определения эффективности нокдауна и уровня экспрессии эндогенного белка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте антитела к целевому белку, а также соответствующие антитела в качестве контроля загрузки. Эффективность нокдауна следует определять путем нанесения убывающих количеств лизатов контрольных клеток (трансфецированных контрольной siRNA) для построения кривой титрования (например, 1, ½, ¼, ⅛).
