1. Инокуляция вирусом и очистка вирусоподобных частиц (ВПЧ) из растений Nicotiana benthamiana С помощью набора T7-mMessage mMachine от Ambion синтезируйте кэпированные Т7-РНК-транскрипты на основе векторных плазмид вируса X картофеля (PVX), несущих гены белка оболочки (CP) вируса rayado fino кукурузы (MRFV) дикого типа (wt) и с мутацией по цистеину. Для каждой реакции синтеза Т7-транскрипта инокулируйте две полностью развернутых листа N. benthamiana 10 мкл реакционной смеси и инкубируйте растения в теплице в течение 10 дней при влажности 60%, со световым режимом 16 ч (25 000–30 000 люкс) при 25 °C и 8 ч темноты при 20 °C. Соберите инфицированные вирусом листья N. benthamiana через 10 дней после инокуляции (dpi), взвесьте растительную ткань (50 г) и поместите на лед. Гомогенизируйте растительный материал в блендере в присутствии 100 мл охлажденного 0,5 М натрий-цитратного буфера (pH 5,5); используйте 2 мл буфера на грамм растительной ткани. Профильтруйте гомогенат через 3 слоя марли и осветлите путем центрифугирования при 27 000 × g в течение 30 мин. Перенесите супернатант в охлажденный мерный цилиндр, измерьте объем, а затем перелейте в охлажденный стерильный стакан. Осадок удалите. Обработайте супернатант, добавив 10% полиэтиленгликоля 8 000 (ПЭГ 8 000), перемешивайте в течение 15 мин при 4 °C и инкубируйте еще 45 мин при 4 °C для осаждения комплекса ВПЧ-ПЭГ. Центрифугируйте образец при 27 000 × g в течение 20 мин при 4 °C и слейте супернатант. Обработайте осадок, добавив 8 мл 0,05 М натрий-цитратного буфера (pH 5,5), содержащего 2% Triton X-100. Тщательно перемешайте пробирки круговыми движениями для ресуспендирования осадка. Перенесите осадок и буфер в охлажденный стерильный стакан. Немедленно промойте пробирки 2 мл того же буфера и добавьте его в стакан. Перемешивайте суспензию при 4 °C до полного растворения осадка (обычно 1 ч). Осветлите путем центрифугирования в течение 5 мин при 27 000 × g, удалите осадок, и подвергните супернатант центрифугированию при 140 000 × g в течение 2 ч при 4 °C. Ресуспендируйте осадок в 1 мл 0,05 М натрий-цитратного буфера (pH 5,5) и нанесите суспензию на 10–40% градиент сахарозы, приготовленный на 0,05 М натрий-цитратном буфере (pH 5,5). Центрифугируйте градиент в течение 3 ч при 140 000 × g при 4 °C. Осветите верхнюю часть центрифужной пробирки и соберите верхнюю полосу с рассеиванием света на расстоянии 4 см от верха пробирки; разбавьте ее 0,05 М натрий-цитратным буфером (pH 5,5) и центрифугируйте в течение 3 ч при 140 000 × g при 4 °C. Ресуспендируйте осадок в 0,5 мл стерильной воды и храните при 4 °C до шести месяцев. Определите концентрацию ВПЧ с помощью белкового анализа по методу Брэдфорда. Выход ВПЧ составляет от 1 до 3 мкг/г растительной ткани. 2. Реакции мечения ВПЧ флуоресцеин-5-малеимидом Приготовьте 1 мМ раствор флуоресцеин-5-малеимида (427,37 г/моль) в 50 мМ натрий-фосфатном буфере (pH 7,0) с добавлением 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Перемешайте на вортексе и убедитесь в полном растворении. Защитите пробирку от света с помощью алюминиевой фольги. Добавьте флуоресцеин-5-малеимид к ВПЧ, полученным на этапе 1, и перемешайте. Используйте 25-кратный молярный избыток флуоресцеин-5-малеимида по отношению к молярному количеству сульфгидрильных групп. Как правило, использование 30 мкл ВПЧ в концентрации 1 мкг/мкл и 60 мкл раствора флуоресцеин-5-малеимида дает приемлемые результаты. Инкубируйте реакционную смесь в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C. Остановите реакцию, добавив дитиотреитол (ДТТ) до конечной концентрации 50 мМ. Удалите непрореагировавший флуоресцеин с помощью опресняющей спин-колонки (Thermo Scientific Inc., Рокфорд, Иллинойс) и центрифугирования в течение 2 мин при 1 500 × g при комнатной температуре. Для анализа методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) добавьте 10 мкл 2-кратного буфера Лаеммсли для образцов SDS-PAGE к 10 мкл каждой реакционной смеси. Храните меченый белок в защищенном от света месте при 4 °C до одного месяца или в однократных аликвотах при -20 °C до 3 месяцев. Натилья А., Хаммонд Р. У. Анализ доступности растворителю остатков цистеина в вирусоподобных частицах вируса Maize rayado fino, полученных в растениях Nicotiana benthamiana, и кросс-линкинг пептидов с ВЛЧ. J. Vis. Exp. (2013)
В данном видео демонстрируется сайт-специфичное флуоресцентное мечение мутантных вирусоподобных частиц (ВПЧ), полученных в Nicotiana benthamiana с использованием тиол-реактивного красителя, с последующей очисткой и гель-электрофорезом для подтверждения модификации поверхности.
