Флуоресцентная функционализация вирусоподобных частиц посредством восстановления дисульфидных мостиков

Аннотация

Конъюгирование соединений диброммалеимида (DB) с бактериофагом Qβ Восстановление дисульфидных связей в Qβ. Растворите 0,0020 г трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) в 1 мл ультрачистой воды для приготовления 100-кратного стокового раствора. ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте свежий раствор TCEP непосредственно перед восстановлением. Добавьте 200 мкл Qβ (5 мг/мл) в микроцентрифужную пробирку. Затем добавьте 20 мкл 100-кратного стокового раствора TCEP. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч. Повторное замыкание восстановленных дисульфидных связей с помощью диброммалеимид-полиэтиленгликоля (DB-PEG). Растворите 0,0017 г диброммалеимид-полиэтиленгликоля (DB-PEG) в 100 мкл DMF. Добавьте 680 мкл 10 мМ раствора фосфата натрия (pH 5). Добавьте восстановленный Qβ в раствор DB-PEG и наблюдайте за процессом смешивания под УФ-лампой (ультрафиолетовой) с длиной волны 365 нм. Ярко-желтая флуоресценция может быть визуализирована сразу после смешивания с помощью ручной УФ-лампы 365 нм. Оставьте реакционную смесь на ночь при комнатной температуре (RT) на ротаторе. Очистите реакционную смесь с помощью центрифужного фильтра (порог отсечения по молекулярной массе (MWCO) = 10 кДа) трижды, используя 1x PBS (фосфатно-солевой буфер), при 3283 x g в течение 20 мин при 4 °C. Контролируйте конъюгацию с помощью невосстанавливающего SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и нативного агарозного электрофореза. ПРИМЕЧАНИЕ: VLP (вирусоподобные частицы) в нативном агарозном геле мигрируют в виде целых частиц и разделяются в зависимости от их заряда, размера и формы. Чэнь, Z., и др. Создание флуоресцентных ПЭГилированных вирусоподобных частиц посредством конъюгации с использованием химии диброммалеимид-дисульфида. J. Vis. Exp. (2018)

В данном видео демонстрируется флуоресцентная функционализация вирусоподобных частиц путем восстановления дисульфидных мостиков с последующим их соединением с помощью линкера из полиэтиленгликоля (PEG), что позволяет создавать стабильные отслеживаемые конъюгаты, подходящие для клеточной визуализации и направленной доставки в биомедицинских целях.

Протокол

1. Конъюгация соединений диброммалеимида (DB) с бактериофагом Qβ

1. Восстановление дисульфидных связей в Qβ.
   1. Растворите 0,0020 g трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) в 1 mL ультрачистой воды для приготовления 100-кратного основного раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте свежий раствор TCEP непосредственно перед восстановлением.
   2. Перенесите 200 µL Qβ (5 mg/mL) в микроцентрифужную пробирку.
   3. Добавьте 20 µL 100-кратного основного раствора TCEP.
   4. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч.
2. Восстановление дисульфидных мостиков с помощью диброммалеимид-полиэтиленгликоля (DB-PEG).
   1. Растворите 0,0017 g диброммалеимид-полиэтиленгликоля (DB-PEG) в 100 µL DMF.
   2. Добавьте 680 µL 10 mM раствора фосфата натрия (pH 5).
   3. Добавьте восстановленный Qβ в раствор DB-PEG и наблюдайте за процессом перемешивания под УФ-лампой (ультрафиолетовой) с длиной волны 365 nm. Ярко-желтая флуоресценция может быть визуализирована с помощью ручной УФ-лампы 365 nm сразу после перемешивания.
   4. Оставьте реакционную смесь на ночь при комнатной температуре (RT) на ротаторе.
3. Очистите реакционную смесь с помощью центрифужного фильтра (предел отсечки по молекулярной массе (MWCO) = 10 kDa) трижды, используя 1x PBS (фосфатно-солевой буфер), при 3,283 x g в течение 20 мин при 4 °C.
4. Контролируйте конъюгацию с помощью невосстанавливающего SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и нативного электрофореза в агарозном геле.
   ПРИМЕЧАНИЕ: VLP (вирусоподобные частицы) в нативном агарозном геле мигрируют в виде целых частиц и разделяются в зависимости от их заряда, размера и формы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2,3-диброммалеинимид 97%	Sigma Aldrich	553603-5G
Полиэтиленгликоль	Alfa Aesar	41561-22
Фосфат натрия	Fisher Scientific	AC424375000
Акриламид/бисакриламид	P212121	RP-A11310-500.0
Додецилсульфат натрия	Sigma Aldrich	L3771-100G
Персульфат аммония	Fisher Scientific	BP179-100
Центрифужные фильтры Amicon Ultra-4	Millipore Sigma	UFC801024
Конические центрифужные пробирки Falcon 15 мл	Fisher Scientific	14-959-53A
Микроцентрифужная пробирка: 1,5 мл	Fisher Scientific	05-408-129
Орбитальный шейкер VWR Os-500	VWR Scientifc Products	14005-830
Дозатор Pipetman P1000	Gilson	F123602
Дозатор Pipetman P200	Gilson	F123601
Дозатор Pipetman P100	Gilson	F123615
Дозатор Pipetman P20	Gilson	F123600
Дозатор Pipetman P10	Gilson	F144802
Высокоточные лабораторные весы Intel Weighing PM-100 Laboratory classic	Intelligent Weighting Technology	IWT_PM100