Безопасная подготовка вирусных образцов для просвечивающей электронной микроскопии

Аннотация

Источник: Blancett, C. D., и др.Использование капсул для негативного контрастирования вирусных образцов в условиях биологической изоляции. J. Vis. Exp. (2017).

В данном видео демонстрируется безопасная подготовка образцов вируса для просвечивающей электронной микроскопии. Вирусные частицы фиксируют глутаральдегидом, окрашивают электронно-плотным агентом и подвергают воздействию паров тетраоксида осмия для стабилизации структур и обеспечения полной инактивации, что гарантирует безопасность при работе с вирусными образцами и повышает контрастность для получения высококачественных ПЭМ-изображений.

Протокол

1. Капсульный метод негативного контрастирования в условиях биологической изоляции с использованием водного глутарового альдегида и инактивации парами 1% тетраоксида осмия

1. Внутри бокса биологической безопасности (БББ) зоны биологической защиты наберите 40 µL суспензии вируса в капсулу, прикрепленную к пипетке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пипетка остается прикрепленной к капсуле до завершения процесса.
2. Положите пипетку на бок на 10 min так, чтобы сетки были ориентированы горизонтально. Это необходимо для обеспечения равномерного распределения вирусных частиц по покрытым сеткам.
3. Инактивируйте вирус внутри капсулы в БББ зоны биологической защиты.
   1. Возьмите пипетку и нажмите на поршень, чтобы слить вирусный раствор в контейнер для отходов.
   2. Наберите 40 µL 2% глутарового альдегида (фиксатора) в капсулы. Осторожно: глутаровый альдегид является опасным химическим веществом и требует использования соответствующих средств защиты. Глутаровый альдегид можно использовать в течение короткого времени в обычном БББ, но при длительном использовании открытого реагента необходимо работать в БББ с вытяжкой или в химическом вытяжном шкафу.
   3. Положите пипетку на бок на 20 min. Это необходимо для обеспечения качественной фиксации образцов.
   4. Удалите фиксатор и наберите 40 µL деионизированной (DI) воды в капсулы, чтобы вымыть фиксатор. Повторите этот этап промывки до достижения общего количества 3 циклов промывки.
4. Наберите 40 µL либо 1% ацетата уранила (UA), либо 1% фосфовольфрамовой кислоты калия (PTA) в капсулы и оставьте на 30 s.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время окрашивания может варьироваться от 10 s до 1 min в зависимости от образца вируса.
   ОСТОРОЖНО: UA является альфа-излучателем и кумулятивным токсином. Работайте с ним с использованием соответствующих средств защиты.
5. Снимите капсулу с пипетки и промокните сетки насухо, приложив кусочек фильтровальной бумаги к краю сеток, пока сетки остаются внутри капсулы.
6. Процедура инактивации парами тетраоксида осмия.
   1. Поместите капсулу с открытой крышкой в центрифужную пробирку объемом 50 mL, содержащую фильтровальную бумагу, пропитанную 1% раствором тетраоксида осмия. Осторожно: тетраоксид осмия чрезвычайно токсичен и обладает низким давлением пара. Его следует использовать в БББ с вытяжкой или в химическом вытяжном шкафу. Работайте с ним с использованием соответствующих средств защиты. Разместите предупреждающую информацию в рабочей зоне.
   2. Герметично закройте центрифужную пробирку объемом 50 mL на 1 h для полного проникновения паров тетраоксида осмия. Затем проведите деконтаминацию и переместите пробирку из зоны биологической защиты в помещение для электронной микроскопии (EM) уровня BSL-2.
7. Извлеките сетки для ЭМ из капсулы.
   1. В помещении для ЭМ уровня BSL-2 извлеките капсулу из центрифужной пробирки и установите ее на пипетку.
   2. Наберите 40 µL деионизированной воды в капсулу и слейте воду в контейнер для отходов трижды.
   3. Снимите капсулу с пипетки и промокните сетки насухо, приложив фильтровальную бумагу к краю сеток.
   4. После высушивания на воздухе храните сетки для последующей просвечивающей электронной микроскопии (TEM).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
TEM-сетки с покрытием из Formvar/углерода	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
Капсулы mPrep/g	EMS	85010-01	box
Соединители mPrep/f	EMS	85010-11	standard 16/Pk
Глутаральдегид	EMS	16320	50% раствор, EM grade
Тетраоксид осмия	EMS	19190	4% водный раствор
Уранил-ацетат	EMS	22400	порошок
Фосфовольфрамовая кислота калия	EMS	19500	порошок
Фильтровальная бумага	Whatman	1450-090	размер 50
Просвечивающий электронный микроскоп	JEOL	JEM-1011	TEM