Детекция интермедиатов репликации дцРНК вируса Зика методом иммуноцитохимии

Аннотация

1. Анализ репликации генома вируса Зика Высейте наивные клетки Vero с плотностью 1 x 10⁵ клеток на лунку в объеме 2 мл, используя 12-луночный планшет. На следующий день в трех повторностях приготовьте вирусные инокуляты с низким и высоким титром (множественность заражения (MOI) 0,01 и 0,1; 400 мкл/лунку), используя безсывороточную среду. Для имитации инфекции (mock-инфекции) используйте только безсывороточную среду (400 мкл/лунку). Инкубируйте инокулированный планшет при 37 °C в атмосфере 5% CO₂ в течение 4–6 часов. Распределите инокулят, аккуратно наклоняя планшет в стороны каждый час. По окончании инкубации замените инокулят средой с добавлением сыворотки (2 мл на лунку). Через 48 и 96 часов соберите образцы для иммуноцитохимического анализа (ИЦХ). Проведите ИЦХ на клетках, фиксированных метанолом. Промойте фиксированные клетки трижды 1x фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и блокируйте буфером для блокировки при ИЦХ (3% сыворотка козы, 3% бычий сывороточный альбумин (BSA), 0,1% Triton-x 100 в PBS). Используйте мышиные моноклональные антитела J2 к dsRNA (1 мкг/мл) в разведении 1:100 в блокирующем буфере; инкубируйте в течение ночи при 4 °C. Промойте клетки 1x PBS, добавьте вторичные антитела (козьи антитела к мышиному IgG-594 (1 мкг/мл)) в разведении 1:1000 в блокирующем буфере и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре. Промойте клетки 1x PBS, окрасьте ядра красителем Hoechst и изучите клетки с помощью флуоресцентного микроскопа при 100-кратном увеличении (Рисунок 1). Контрерас, Д., и др.Система инфицирования клеточных культур вирусом Зика и профилактический эффект интерферонов in vitro. J. Vis. Exp. (2016)

В видео демонстрируется метод обнаружения промежуточных продуктов dsRNA вируса Зика в инфицированных эпителиальных клетках с помощью иммуноцитохимии. Инфицированные клетки фиксируют, после чего обрабатывают блокирующим раствором. Затем добавляют первичные и вторичные антитела. Ядра окрашивают флуоресцентным красителем. После этого меченая вирусная dsRNA визуализируется с помощью флуоресцентного микроскопа.

Протокол

1. Анализ репликации генома вируса Зика

1. Высейте неинфицированные клетки Vero с плотностью 1 x 10⁵ клеток на лунку в объеме 2 ml, используя 12-луночный планшет. На следующий день приготовьте в трех повторностях вирусные инокуляты низкого и высокого титра (множественность заражения (MOI) 0,01 и 0,1; 400 µl/лунку), используя безсывороточную среду. Для имитации инфекции (mock-инфекции) используйте только безсывороточную среду (400 µl/лунку).
2. Инкубируйте инокулированный планшет при 37 °C в атмосфере 5% CO₂ в течение 4-6 hr. Распределяйте инокулят, осторожно наклоняя планшет в стороны каждый час.
3. По окончании инкубации замените инокулят средой с добавлением сыворотки (2 ml на лунку).
4. Через 48 и 96 hr соберите образцы для иммуноцитохимического анализа (ICC).
5. Проведите ICC на клетках, фиксированных метанолом.
   1. Трижды промойте фиксированные клетки 1x фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и подвергните блокировке с использованием блокирующего буфера для ICC (3% сыворотка козы, 3% бычий сывороточный альбумин (BSA), 0,1% Triton-x 100 в PBS).
   2. Используйте мышиные моноклональные антитела к dsRNA J2 (1 µg/ml) в разведении 1:100 в блокирующем буфере и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
   3. Промойте клетки 1x PBS, добавьте вторичные антитела (козьи антимышиные IgG-594) (1 µg/ml) в разведении 1:1 000 в блокирующем буфере и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре.
   4. Промойте клетки 1x PBS, окрасьте ядра красителем Hoechst и изучите клетки с помощью флуоресцентного микроскопа при 100-кратном увеличении (Figure 1).

Результаты

Рисунок 1: Методы оценки репликации вируса Zika (ZIKV). (A) На графике показано содержание генома вируса Zika, измеренное с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-qPCR). Праймеры как для всех генотипов (ZIKV GEN), так и для штамма PRVABC59 (ZIKV UNI) продемонстрировали одинаковую чувствительность и специфичность. Как и ожидалось, праймеры к вирусу гепатита C (HCV) не дали продуктов амплификации. (B) На графике представлена кинетика роста вируса Zika в указанные временные точки в клетках, инфицированных низким и высоким титром вируса, по сравнению с неинфицированным ложноинфицированным контролем. Приведены средние значения и стандартные отклонения. (C) Иммуноцитохимический анализ для исследования вирусной репликации. Клетки, инфицированные вирусом Zika, были специфически окрашены антителами к dsRNA. Через 48 чпи инфицированные клетки сосредоточены в нескольких кластерах, тогда как через 96 чпи инфицировано большинство клеток. Для визуализации ядер использовали окрашивание Hoechst (масштабная линейка = 50 µm). BF: изображение в светлом поле.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM)	Sigma Life Science	D5796
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
Мышиные моноклональные антитела к dsRNA J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Козьи антитела к IgG кролика Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
Клеточная линия Vero	ATCC	CCL-81
Штамм вируса Зика PRVABC59	Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
Иммунофлуоресцентный микроскоп Nikon Eclipse Ti с системой освещения Nikon Intenselight C-HGFI	Nikon	Visit Nikon for Request