Концентрирование и очистка вируса. Приготовьте 5-кратный раствор полиэтиленгликоля 6000, добавив 40% полиэтиленгликоля 6000 и 1,5 М NaCl в ddH2O. Автоклавируйте раствор в режиме для жидкостей в течение 45 мин при 121 °C. При охлаждении медленно перемешивайте раствор. ПРИМЕЧАНИЕ: раствор сначала будет мутным, а по мере охлаждения станет прозрачным. Центрифугируйте коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую обе порции вирусного супернатанта, при 2000 x g в течение 10 мин для осаждения нерастворимых материалов. Очистите вирусную среду, профильтровав ее через шприцевой фильтр с низким связыванием белков с размером пор 0,45 мкм (PES или PVDF). Добавьте 5-кратный раствор полиэтиленгликоля 6000 в среду (конечная концентрация должна составлять 8% полиэтиленгликоля 6000 и 0,3 М NaCl). Перемешайте, несколько раз перевернув пробирку (не используйте вортекс). Инкубируйте раствор полиэтиленгликоля, содержащий вирус, при 4 °C в течение 12 и более часов, время от времени повторно перемешивая. (День 9) Центрифугируйте раствор полиэтиленгликоля, содержащий вирус, при 2500 x g в течение 45 мин. Удалите и утилизируйте супернатант, затем снова центрифугируйте в течение 2 мин. Снова удалите и утилизируйте супернатант. Ресуспендируйте осадок, добавив 320 мкл стерильного фосфатно-солевого буферного раствора (320 мкл составляют 1/100 часть исходного объема собранной вирусной среды), и инкубируйте в течение ночи при 4 °C. Опционально суспендируйте осадок при комнатной температуре на шейкере-балансире в течение 30 мин. После ресуспендирования осадка разделите вирус на аликвоты (5–10 мкл на пробирку 0,5 мл) и заморозьте аликвоты при -80 °C (замораживание-оттаивание или хранение при 4 °C резко снизят титр). Определите титр вирусов с помощью стандартных протоколов, т. е. проведите серию разведений на 6-луночном планшете с клетками HEK293T и через 48 часов вручную подсчитайте количество флуоресцентных колоний. Фрикано-Куглер, К. Дж., и др. Проектирование, упаковка и доставка высокотитражных CRISPR-ретро- и лентивирусов посредством стереотаксической инъекции. J. Vis. Exp. (2016).
В данном видео демонстрируется пошаговый процесс концентрирования и очистки лентивирусных частиц из смешанной суспензии, содержащей остатки клеток-хозяев. В процедуре используются центрифугирование, фильтрация и осаждение с помощью ПЭГ-соли для выделения вирусных частиц с одновременным удалением растворимых примесей. Конечный продукт ресуспендируют в буфере и хранят при сверхнизких температурах для сохранения инфекционности и структурной целостности вируса.
