Оценка системы жидкого оверлея для проведения метода бляшек при определении титра вируса

Аннотация

Источник: Baer, A. and Kehn-Hall, K. Определение вирусной концентрации с помощью метода бляшек: использование традиционных и новых систем наложения. J. Vis. Exp.. (2014).

В данном видео демонстрируется использование жидкого покрытия на основе микрокристаллической целлюлозы в методе определения титра вируса по количеству бляшек путем сравнения его эффективности в формировании вирусных бляшек с традиционным полужидким агарозным покрытием.

Протокол

1. Подготовка клеток и реагентов

1. За день до проведения анализа посейте соответствующие клетки-хозяева для исследуемого вируса (Таблица 1 и Таблица 2) до достижения конфлюэнтности 90–100%.
2. Приготовьте фиксирующий раствор 10% формальдегида в H₂O. Например, смешайте 5,56 мл 36% стокового раствора формальдегида с 14,44 мл дистиллированной H₂O (dH₂O).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с формальдегидом соблюдайте надлежащие меры техники безопасности и обеспечьте вентиляцию.
3. Приготовьте краситель кристаллический фиолетовый: 1% кристаллического фиолетового (CV) в 20% этаноле и dH₂O.
4. Приготовьте 2-кратную среду для определения бляшек (состав зависит от типа клеток при 2-кратной концентрации; см. Таблицу 2). Если какие-либо реагенты не стерильны, профильтруйте раствор через фильтр 0,2 µm.
5. Приготовление иммобилизующих оверлеев (Таблица 3)
   1. Для жидких оверлеев приготовьте стерильный 2,4% раствор Avicel в dH₂O. Чтобы предотвратить комкование, добавляйте порошок в колбу с водой при интенсивном перемешивании с помощью магнитной мешалки; медленно всыпайте Avicel и быстро перемешивайте при комнатной температуре (RT). Когда раствор станет слишком вязким для гомогенизации магнитной мешалкой, перенесите его в шейкер для колб на >30 мин при сильном встряхивании для обеспечения равномерной гомогенизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стоковые растворы можно готовить в более низких концентрациях, однако такие растворы могут расслоиться и потребуют повторного перемешивания для гомогенизации. Можно использовать рабочие растворы Avicel в диапазоне от 0,6–3%.
   2. После гомогенизации проавтоклавируйте раствор и храните его в герметично закрытом виде при RT.
   3. Для агарозных и карбоксиметилцеллюлозных (CMC) оверлеев приготовьте стоковый раствор 2% CMC или 0,6% агарозы в dH₂O. Перемешайте с помощью магнитной мешалки и проавтоклавируйте или нагрейте в микроволновой печи до полного растворения.

2. Разведения и инфицирование

1. На следующий день после посева, перед началом анализа, визуально проверьте конфлюэнтность и жизнеспособность клеток. Убедитесь в наличии стандартной морфологии клеток и того, что сформировался монослой с конфлюэнтностью ~90%.
2. Выполните десятикратное серийное разведение инфицированных образцов. В качестве разбавителя используйте среду для роста клеток, применяемую для размножения вируса (Таблица 2). Количество необходимых разведений варьируйте в зависимости от ожидаемого титра исследуемого вируса; всегда используйте неинфицированный контрольный образец, чтобы независимо подтвердить жизнеспособность клеток и облегчить идентификацию бляшек.
3. Используя серийные разведения, инфицируйте клетки в течение от 45 мин до 1 ч (Таблица 1). Используйте достаточный объем инокулята, чтобы покрыть клетки, при этом стараясь минимизировать объем для максимального контакта вируса с монослоем (Таблица 4). Аккуратно покачивайте планшеты каждые 20 мин, чтобы обеспечить равномерное покрытие и предотвратить высыхание клеточного монослоя.
4. После инфицирования нанесите соответствующий объем иммобилизующей среды непосредственно на инокулят в лунке (Таблица 2), используя смесь 1:1 из 2-кратной среды для бляшек и выбранного иммобилизующего покрытия (КМЦ, агароза или Avicel). Аккуратно покачайте для перемешивания.
   1. Для жидких покрытий смешайте в пропорции 1:1 подогретую 2-кратную среду для бляшек и стоковый раствор Avicel 1,2–2,4% при комнатной температуре, чтобы получить рабочий раствор среды для покрытия Avicel с концентрацией 0,6–1,2%.
   2. Для агарозного покрытия используйте смесь 1:1 из подогретой 2-кратной среды для бляшек и стокового раствора нагретой 0,6% агарозы; поместите смесь в водяную баню при 56 °C на 30 мин для выравнивания температуры, чтобы получить конечную концентрацию агарозы в покрытии 0,3%.
   3. Для КМЦ приготовьте 2% стоковый раствор и используйте его так же, как описано для агарозного покрытия.
   4. При нанесении покрытия на монослой всегда выдерживайте горячую агарозу или КМЦ в воде при 56 °C, чтобы предотвратить повреждение монослоя. Убедитесь, что раствор теплый, но не обжигает при прикосновении, чтобы избежать гибели клеток и снижения вирусных титров. Большинство агарозных покрытий начинают затвердевать при температуре ниже 42 °C, поэтому работайте быстро и/или готовьте небольшими порциями, чтобы предотвратить затвердевание во время манипуляций.
5. После добавления покрытия инкубируйте планшеты до появления четких, легко подсчитываемых бляшек. Образование бляшек может занять от 2 до 14 дней в зависимости от анализируемого вируса (Таблица 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: После помещения планшетов с жидким покрытием в инкубатор не перемещайте их. Смещение жидких покрытий в период инкубации приведет к размытию бляшек. Покрытия из агарозы и КМЦ являются полутвердыми, поэтому их можно перемещать или периодически проверять под световым микроскопом для мониторинга развития бляшек.

3. Фиксация и окрашивание клеток

1. Для фиксации клеток слейте или аспирируйте оверлей из Avicel, затем зафиксируйте клетки, используя 10% раствор формальдегида в течение 30 мин или до следующего дня (<1 ml на лунку для 6-луночного планшета).
   1. Для агарозы или КМЦ добавьте раствор формальдегида непосредственно в оверлей на 1 ч или до следующего дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить в фиксаторе в течение длительного времени при условии, что он не испарится и не высохнет, так как это может привести к деформации монослоя.
2. Перед окрашиванием и после фиксации удалите формальдегид и уберите полутвердые пробки агарозы и КМЦ с помощью проточной воды или вручную шпателем. Промойте бляшки в Avicel водой для удаления остатков оверлея/фиксатора перед окрашиванием.
3. Для окрашивания покройте клетки минимальным количеством раствора кристаллического фиолетового на ~15 мин. При необходимости покачивайте планшеты для обеспечения равномерного покрытия.
4. Осторожно смойте краситель кристаллический фиолетовый водой. После фиксации, окрашивания и высушивания бляшки можно хранить неопределенно долго для последующего анализа.

Таблица 1. Условия инокуляции и типы клеток при проведении метода бляшек

	RVFV	VEEV	Грипп B
Тип клеток	Vero	Vero	MDCK
Период инфицирования	1 ч	1 ч	45 мин
Время инкубации	3 дня	2 дня	3 дня

 

Таблица 2. Среды для формирования бляшек и вирусного/клеточного роста

	RVFV	VEEV	Грипп B
Тип клеток	Vero	Vero	MDCK
Тип роста	DMEM1	DMEM1	DMEM2
Среда для определения количества бляшек	2xEMEMA	2xEMEMA	2xEMEMB

1. Модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко с добавлением 10% эмбриональной сыворотки быка, 1% L-глутамина, 1% пенициллина/стрептомицина.

2. Модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко с добавлением 1% L-глутамина, 1% пенициллина/стрептомицина, 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 0,025% HEPES, DEAE-декстрана 50ug/ml.

A. 2-кратная минимальная незаменимая среда (500 ml) с добавлением 5% FBS (25 ml), 1% минимальных незаменимых аминокислот (5 ml), 1% пирувата натрия (5 ml), 1% L-глутамина (5 ml), 2% Pen/Strep (10 ml).

B. 2х минимальная эссенциальная среда (500 ml) с добавлением 0.2% бычьего сывороточного альбумина, 1% минимального набора эссенциальных аминокислот (5 ml), 50ug/ml, 0.025% HEPES, DEAE-декстрана, трипсина-TPCK*

*Непосредственно перед приготовлением добавьте 1 µl на 25 ml стокового раствора TPCK-Trypsin в концентрации 2 µg/ml в ту аликвоту, которую вы будете смешивать с агарозой для формирования бляшек.

Таблица 3. Запас overlays

	RVFV	VEEV	Грипп B
Тип клеток	Vero	Vero	MDCK
Период инфицирования	1 ч	1 ч	45 мин
Время инкубации	3 дня	2 дня	3 дня

 

Таблица 4. Форматы планшетов

	6-луночный	12-луночный	96-луночный
Кол-во клеток на лунку	5 x 105	2.5 x 105	3 x 104
Объем инокулята (μl)	400	200	50
Объем оверлея (ml)	3	1.5	0.100

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Кристаллический фиолетовый	Sigma Aldrich	C3886-25G
Раствор формальдегида	Sigma Aldrich	F8775-500мл
Avicel RC-591 NF	FMC BioPolymer USA	RC-591 NF	Тщательно встряхните при восстановлении для >30 минут для гомогенизации
агароза UltraPure	Invitrogen	16500-100
Карбоксиметилцеллюлоза, натриевая соль, средняя вязкость	Sigma Aldrich	C4888