Разработка пользовательских яичника китайского хомячка, клетки-хозяина белка Анализы использованием Акустические технологии, микрочастицы Мембранные

Краткое содержание

Развитие пользовательских тестов на платформе ViBE для более чувствительны, воспроизводимы, автоматизированные результаты в сложных матрицах описывается. Картридж универсальный позволяет анализы, чтобы быть легко адаптированы для использования с помощью пользовательских тестов. Такая универсальность позволяет быструю разработку и проверку новых анализов или автоматизированные версии существующих ручных тестов, примером в этом видео.

Аннотация

Специализированные анализы для уникальных белков часто ограничиваются трудоемкими методами ручного обнаружения и количественного определения, такими как ELISA или вестерн-блоттинг, из-за сложности разработки на альтернативных платформах. Запатентованная технология акустических мембранных микрочастиц (AMMP) от компании BioScale позволяет легко разрабатывать сэндвич-иммуноанализы для использования на платформе ViBE, обеспечивая более высокую чувствительность, воспроизводимость и автоматизацию работы. В качестве примера в данном протоколе описывается процедура разработки специализированного анализа белков клеток-хозяев китайского хомячка (CHO-HCP). Изложенные здесь общие принципы могут быть применены для разработки самых разнообразных иммуноанализов.

Метод AMMP позволяет определить концентрацию антигена путем измерения изменений частоты осцилляции, вызванных связыванием микрочастиц с поверхностью сенсора. Он состоит из четырех основных компонентов: (1) картриджа, содержащего функционализированный чип с восемью сенсорами, (2) магнитных микрочастиц, меченных антителами, (3) антител с гаптеном, которые связываются с поверхностью функционализированного чипа, (4) образцов, содержащих исследуемый антиген. Биосенсор компании BioScale представляет собой резонансное устройство, содержащее восемь отдельных мембран с разделенными микрофлюидными каналами. Частота осцилляции мембран изменяется в ответ на накопление массы на поверхности, и это изменение частоты используется для количественного определения массы добавленного вещества.

Для обеспечения возможности использования в широком спектре иммуноанализов сенсор функционализируют антителом к гаптену. Специфические для анализа антитела модифицируют путем ковалентного конъюгата гаптеновой метки к одному антителу и биотина к другому. Биотиновая метка используется для связывания антитела с магнитными частицами, конъюгированными со стрептавидином, которые в сочетании с антителом с гаптеновой меткой используются для захвата аналита по принципу «сэндвича». Комплекс связывается с чипом посредством взаимодействия антитела к гаптену с гаптеном. В конце каждого цикла анализа сенсоры промывают разбавленным кислотным раствором, что позволяет проводить последовательный анализ колонок из 96-луночного планшета.

В данном материале представлен метод разработки специализированного анализа CHO-HCP методом AMMP для оптимизации биопроцессов. Разработка анализов AMMP или модификация существующих методов в формат AMMP позволяют добиться более высоких показателей (воспроизводимости, чувствительности) при работе со сложными образцами и сократить время работы оператора. В протоколе описаны этапы разработки, а в разделе обсуждения представлены репрезентативные результаты. Для получения более подробных разъяснений по параметрам оптимизации и настройки анализа обратитесь в компанию BioScale. Данный набор содержит стандартные анализы для разработки биопроцессов, такие как определение остаточного белка А, титра продукта и CHO-HCP.

Протокол

1. Подготовка микрочастицы

1. Этикетка Антитела использованием биотина NHS химии
2. Определение степени биотинилирование
3. Конъюгата стрептавидин Бусины с биотинилированных антител
   1. Ресуспендируют бисером в оригинальном флаконе на вортексе в течение 1-2 минут
   2. Алиготе желаемый объем из бисера в микроцентрифужных трубки
   3. Вымойте бисером 3 раза PBST:
      1. Место трубку с бисером на магнит в течение 2 минут
      2. Удалить супернатант аспирацией с трубки на магнит. Будьте осторожны, чтобы не нарушить бисером
      3. Снимите трубку от магнита и добавьте 1 мл PBST
      4. Vortex в течение 20 секунд для ресуспендирования бисером
      5. Центрифуга в течение 5 секунд, чтобы удалить бусы из крышки
      6. Повторите 2.3.1-2.3.5 в два раза больше
   4. После третьего места мыть труба на магните и аспирации PBST
   5. Добавить биотинилированного антитела к бисером и ресуспендирования
   6. При необходимости довести объем биотинилированного антитела до 300 мкл с PBS. Если антитела объем уже превышает 300 мкл не добавляйте PBS
   7. Инкубируйте шарик / антитело подвески в течение 30 минут при комнатной температуре на шейкере или вихревой трубки ротатор
   8. Промыть 3 раза PBST, как в шаге 3.
   9. Блок бусин с BSA биотинилированного
      1. После третьего мытья добавить 10 мкг / мг биотинилированного BSA, регулировать громкость до 300 мкл с PBS в случае необходимости, и инкубировать при перемешивании в течение 30 минут
   10. Промыть 3 раза PBST как в шаге 3
   11. Ресуспендируют бисером в 100 мкл PBS/0.05% BSA. Азид натрия может быть добавлен для длительного хранения
4. Используя стандартные NHS Fluorescein протоколов, fluoresceinate детектор антител
5. Определить степень Fluorescination

2. ГПУ - Разработка

1. Подготовка рабочих растворов:
   1. Fluorescein меченых антител (П-Ab): Большинство СНО-ГПУ анализов использования П-Ab в конечной концентрации 400 нг / мл. П-Ab добавляется ¼ конечного объема теста, поэтому концентрация рабочего раствора составляет 1,6 мкг / мл. Подготовка этого решения путем разбавления вялые мускулы акции с BioScale бисера / вялые мускулы разбавителя.
   2. Бисер: Большинство СНО-ГПУ анализов используют бисер в конечной концентрации 2х10 ⁵ бусин / мл. Бусинка реагента составляет ¼ от конечного объема анализа, поэтому концентрация рабочего раствора 8x10 ⁵ бусин / мл. Подготовка этого решения путем разбавления бусинка акции с BioScale бисера / вялые мускулы разбавителя. Vortex шарик фондового хорошо, чтобы убедиться, что все бисер во взвешенном состоянии до удаления аликвоту.
   3. Запуск буфера: состав работает буфер, возможно, придется быть оптимизированы для антител использованы для разработки анализа, однако несколько СНО-ГПУ тесты были разработаны с использованием 10 мМ HEPES буфера, 1% Tween, рН 7,5. BioScale разработала добавку для работы буфера (поставляется с Development Kit), который добавляется в буфер для концентрации 1% до использования.
2. Развести калибраторов и образцов с BioScale раствора для разведения образцов.

3. ViBE Система Настройка

1. Включите Workstation ViBE на
2. Подключение системы водоснабжения и сточных
3. Премьер системы
4. Вставьте картридж ViBE
5. Маршрут трубы
6. Подготовка анализа шаблонов, заполняя лист с надписью "Пример Setup". BioScale предоставляет возможность иметь один шаблон анализа для каждого анализа Workstation Vibe. Это позволяет пользователю редактировать и сохранять конкретные замечания в "Записках" лист шаблон для различных анализов соответствии полную запись эксперимента.
7. Первоначальный анализ шаблонов в рабочем состоянии: Начните с заполнения таблицы (левый верхний угол) в диапазоне концентраций стандартов в анализе в "Пример установки" листа.
8. Затем введите дополнительную информацию в таблице справа от стандартов (Simple Колонка Прочитано установки Один Добавить реагентов и два реагента Добавить установок) поручить рабочей станции ViBE как долго образцы необходимо инкубировать, сколько объема реагента должно быть передано , как долго образец накопления должна быть, и является ли кондиционирования датчика и обеззараживания проб и картридж необходимо, и т.д.
9. Заполните пластины макета.
10. Нагрузка выборки / реагентов в пластинах. ViBE обеспечит необходимые объемы для реагента пластины. Объем образца может варьироваться, но в половине общего объема анализа в 120 мкл хорошей отправной точкой.
11. Применение пластин крышками. Нагрузка пластин на рабочей станции палубе.
12. Выполнить анализ запуска мастера, пройти мастер и начать анализ.

4. Представитель Результаты

Рисунок 1: AMMP Сэндвич иммуноферментный

На рабочей станции Vibe, анализ AMMP меры концентрации антигена. Сигнал измеряется, когда шарик-антиген-антитело связывается гаптена к датчику через гаптен / анти-гаптен взаимодействия. Регенерация приносит датчика к началу состояние путем удаления иммунных комплексов.

Рисунок 2: СНО-ГПУ AMMP Пробирной калибровочной кривой

Рисунок 2 выше, является примером СНО ГПУ AMMP калибровочной кривой анализа. Анализ может быть выполнен в пробах, взятых по очистке потока, включая реактор с высокой точностью и воспроизводимостью.

Рисунок 3: Белки AMMP калибровочной кривой Пробирной

На рисунке 3 калибровочной кривой для остаточного белка AMMP Анализ, выполненный с VIBE остаточного белка Пробирной Kit. Же комплект может быть использован для быстрого определения на 30 минут инкубационного периода, или на более чувствительных результатов и более широкий динамический диапазон с более длительным инкубационным периодом без потери точности и точности, оба из которых, как правило, лучше, чем эквивалентные ИФА в пользователей руки

Рисунок 4: Продукт Титр AMMP Пробирной

Рабочая станция ViBE также может быть использован для анализа продуктов Титр, результаты, показанные на рисунке 4. Исполняет иначе, чем другие анализы AMMP, это анализ не требует обработки проб, кроме простой разбавления, или бусы, и количественного была проверена в "без отжима" образцов, содержащих более 10 миллионов клеток в широком диапазоне viabilities.

Рисунок 5: AMMP Пробирной стандартной кривой для GST-Gadd34 биомаркеров анализа

Показанный на рисунке 5 является стандартной кривой сигнал, получаемый путем ViBE BioAnalyzer (панель) или AlphaScreen технологии с использованием рекомбинантной GST-Gadd34. Результаты на платформе ViBE были примерно журнал более чувствительными используя те же антитела. AMMP использует измерение меньше крупных частиц и все же выгоды от решения фазы захвата и формирование обнаружения комплекса.

Рисунок 6: AMMP Пробирной стандартной кривой для GST-Gadd34 в опухолевых образцов

На рисунке 6 индукции Gadd34 от CWR22 ксенотрансплантаты был испытан в наличии или отсутствии boronate протеасомы ингибитора, как проанализированы либо ViBE BioAnalyzer (панель) или AlphaScreen (Группа B). Платформа ViBE был способен производить чувствительный, воспроизводимых результатов в естественных условиях в опухоли ксенотрансплантаты в то время как сигнал AlphaScreen гасили с повышенным мкг белка.

Этот пример показывает силу AMMP технологии в очень сложных образцов. Благодаря чувствительным чипом обнаружения и высокой эффективности магнита вблизи чипов, низком количестве магнитных микрочастиц может эффективно и воспроизводимо мусор для низких целевых изобилии среди сложности лизировали сотовой связи (в том числе лизис реагентов) и крови мусора.

Обсуждение

Приведенные примеры демонстрируют AMMP высоко чувствительные количественные результаты в сложных образцов. Этот спектакль, когда поставляется с легкостью и управления форматированием реагентов в системе позволяет для различных приложений. Эти приложения могут быть специфическими для мишени, как в Gadd34 в опухоль, или общие для целого спектра задач, как в клетке-хозяине обнаружения белка и количественное определение в образцах, которые пересекают очистки потока. Низкие платформы ViBE накладных в сочетании с очень гибким AMMP предоставляет мощный инструмент для проведения важных анализов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Набор для NHS-хромогенного биотинилирования или набор для маркировки NHS-хромогенным биотином
Если NHS-хромогенный биотин приобретается в качестве реагента, потребуются следующие дополнительные материалы:
Водорастворимый органический растворитель, такой как диметилсульфоксид (ДМСО) или диметилформамид (ДМФА)
Фосфатно-солевой буфер (PBS) или другой буфер, не содержащий аминов (pH 7 – 9)
Обессоливающие колонки или установки для диализа для замены буфера
Спектрофотометр с возможностью измерения при 354 и 280 нм – для измерения концентраций белка и биотина
Биотинилированное антитело (2–5 биотинов/антитело)
Магнитные бусины со стрептавидином	BioScale		(10 мг/мл) ~108 бусин/мг
Магнит для микроцентрифужных пробирок	New England Biolabs	кат. № S1510S
Биотинилированный БСА для блокировки
Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS)
Фосфатно-солевой буфер с 0,1% Tween 20
Перемешивание на вортексе
Держатель для микроцентрифужных пробирок для вортекса или ротатора
Антитело или белок для мечения
NHS-флуоресцеин или набор для мечения NHS-флуоресцеином
Если NHS-флуоресцеин приобретается в качестве реагента, потребуются следующие дополнительные материалы
Смешивающийся с водой органический растворитель, такой как диметилсульфоксид (DMSO) или диметилформамид (DMF)
50 мМ боратный буфер, pH 8,5 или другой буфер без содержания аминов (pH 7 – 9)
Обессоливающие колонки или установки для диализа для замены буфера
Для измерения концентраций белка и флуоресцеина требуется спектрофотометр, способный проводить измерения на длинах волн 493 и 280 нм.
Разбавитель	BioScale		для разведения микросфер и FlAb
Разбавитель образца	BioScale		для разведения образцов и калибраторов
Добавка в бегущий буфер	BioScale