Загрузка дрозофилы нервными окончаниями с кальцием Индикаторы

Краткое содержание

Кальций является вездесущий посланник в нервной системы, необходимой для запуска выпуска нейротрансмиттера и изменения в синаптической силы. Здесь мы показываем, технику для погрузки Са ^{2 +-индикаторы} в терминалах дрозофилы нерва. Мы также демонстрируют изготовление необходимых приборов и подчеркнуть точки решающее значение для успеха этой техники.

Аннотация

Кальций играет много ролей в нервной системе, но ни один более впечатляющим, чем в качестве триггера для выпуска нейротрансмиттера, и никто более глубоким, чем в качестве посланника необходимо для синаптической пластичности, поддерживающего обучения и памяти. Для дальнейшего выяснения молекулярной основы Са ^{2 +-зависимые} синаптических механизмов, модели требуется система, которая является и генетически ковкого и физиологически доступной. Дрозофилы предоставляет такую ​​модель. В этой системе, генетически закодированы люминесцентные индикаторы доступны для выявления Са ^{2 +} изменения в нервных окончаниях. Тем не менее, эти показатели имеют ограниченные чувствительность к Са ^{2 +} и часто показывают нелинейную реакцию. Синтетические люминесцентные индикаторы лучше подходят для измерения быстрых Са ^{2 +} изменения, связанные с нервной активностью. Здесь мы показываем, технику для погрузки декстран-сопряженных синтетического Ca ^{2 +} показатели в живых нервных окончаний у личинок дрозофилы. Особый акцент делается на тех аспектах протокол наиболее решающее значение для успеха этой техники, например, как избежать статических разрядов электричества вдоль изолированных нервов, поддержании здоровья подготовки в течение длительных периодов погрузки, а также обеспечение аксон выживание, предоставляя Са ^{2 +} содействовать уплотнения разорвала окончаниях аксона. Низкое сродство декстран-сопряженных Са ^{2 +-индикаторы,} такие как флуоресцентные-4 и rhod, доступны, которые показывают высокое отношение сигнал-шум в то время как минимально нарушая пресинаптических Са ^{2 +} динамики. Декстран сопряжения помогает предотвратить Са ^{2 +} показатели, поглощенных в органеллах типа митохондрий. Погрузка техника может быть применена в равной степени к личинки, эмбрионы и взрослых.

Протокол

1. Выберите чистой блюдо рассечение, которое не подвергается какой-либо фиксаторов.
   
   
2. Рассеките блуждающих ^3-го возраста личинки дрозофилы Drosophila в Средние Шнайдера содержащие Са ^{2 +} и L-глутамин, (не отрезайте любой нервы или волокон повреждения мышц № 7, 6, 13 или 12).
   
   
3. Выберите стеклянный заполнения пипетки с 12 микрон наконечник (внутренний диаметр).
   
   
4. Использование шприцев и трубки (для применения отрицательного давления на пипетку) обеспечить, чтобы кончик пипетки ничто не мешает.
   
   
5. Выберите тонкой пластиковой заполнения нити, которые могут быть вставлены по всей длине стеклянной пипетки.
   
   
6. Нарисуйте ~ 1 см 5 мМ декстран-сопряженных Са ^{2 +-индикатор} в пластиковой нити.
   
   
7. Вырезаны все сегменте нервы.
   
   
8. Поддержка пипетки на рампе, которая позволит пипетки подойти к вентральной средней линии расчлененный личинки.
   
   
9. Нарисуйте обрезанный конец нерва сегменте № 4, не щипать нервы, в конце пипетки (включая небольшое количество средних Шнайдера).
   
   
10. Снимите трубку и вставить пластиковую нить в пипетку до конца нити в пределах 50 микрон разреза конца нерва (не дотрагиваясь до нерва).
    
    
11. Извлечь достаточной Са ^{2 +-индикатор} на нервные окончания увеличить объем среды Шнайдера примерно на 33% (конечная концентрация должна быть <2 мм). Важно - Это должно быть завершено в течение 5 минут после резки нерва.
    
    
12. Место препарата в темноте при комнатной температуре в то время как нервные нагрузки.
    
    
13. Через 40 минут удалите Са ^{2 +-индикатора} с помощью нити.
    
    
14. Оставьте пипетки на место и заполнить его полностью со средним свежие Шнайдера, так как это будет использоваться для применения стимулирующих импульсов нерва.
    
    
15. Разрешить Са ^{2 +-индикатор,} чтобы уравновесить в нерв, по крайней мере 60 минут, но не более чем на 4 часа, до начала Са ^{2 +-изображений.}
    
    
16. Промыть подготовки со средним свежие Шнайдера каждые 30 минут во время его уравновешивания.
    
    
17. За 20 минут до визуализации заменить средний Шнайдера с гемолимфы-Like № 6 решения (HL6; Маклеод и др., 2002;. 2003).
    
    
18. L-глутаминовой кислоты или глутамата может быть добавлен к HL6 решение на 7 мм, чтобы уменьшить чувствительность постсинаптических рецепторов глутамата, чтобы предотвратить нервные вызвало сокращение мышц (Маклеод и др., 2004;. Реифф и др., 2002;. 2005).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Среда Шнайдера для насекомых (Schneider’s Insect Medium)	Реагент	Sigma-Aldrich	S0146	должна содержать L-глутамин и кальций
Гидрат мононатриевой соли L-глутаминовой кислоты	Реагент	Sigma-Aldrich	G1626