Методическая статья

Использование Всего горе На месте Гибридизация в ссылку молекулярной биологии и организменном

24.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2533

⸱

31 марта 2011 г.

 ,  , 
1Department of Biology, Syracuse University, 2Department of Science Teaching, Syracuse University

В этой статье

Краткое содержание

Всего горе На месте Гибридизации (желание) был использован в верхнем уровне бакалавриата Сравнительный курс биологии позвоночных, в дополнение к позвоночным вскрытия. Это дало студентам возможность учиться моделей экспрессии генов, а также валовой анатомии, связывая изучение молекулярных и организменном биологии в течение одного курса.

Аннотация

Гибридизация in situ целого препарата (WISH) — это распространенный метод в лабораториях молекулярной биологии, используемый для изучения экспрессии генов путем локализации специфических транскриптов мРНК в целом образце. Данный метод (адаптированный из Albertson and Yelick, 2005) применялся в рамках учебного курса по сравнительной биологии позвоночных для студентов старших курсов бакалавриата в Университете Сиракуз. Первые две трети лабораторного курса по сравнительной биологии позвоночных предоставили студентам возможность изучить эмбриологию и макроанатомию нескольких организмов, представляющих различные таксоны хордовых, преимущественно с помощью традиционного препарирования и использования моделей. Заключительная часть курса включала инновационный подход к преподаванию анатомии через наблюдение за развитием позвоночных с использованием молекулярных методов, в рамках которых проводилась WISH на эмбрионах данио-рерио. Использовалась гетерозиготная линия мутантов по фактору роста фибробластов 8a (fgf8a), ace. В соответствии с законами Менделя, скрещивание особей ace приводило к появлению дикого типа, гетерозигот и гомозиготных мутантов ace/fgf8a в соотношении 1:2:1. Использовались РНК-зонды с известными паттернами экспрессии по срединной линии и в развивающихся анатомических структурах, таких как сердце, сомиты, хвостовая почка, миотом и мозг. WISH проводилась на эмбрионах данио-рерио на стадиях 13 сомитов и prim-6, при этом студенты выполняли реакцию окрашивания непосредственно в аудитории. Изучение эмбрионов данио-рерио на разных стадиях развития позволило студентам пронаблюдать, как эти анатомические структуры меняются в ходе онтогенеза. Кроме того, у некоторых мутантов ace/fgf8a наблюдались неправильное закручивание сердца, а также дефекты развития сомитов и мозга. Студенты в этой лаборатории наблюдали нормальное развитие различных систем органов, используя как внешнюю анатомию, так и паттерны экспрессии генов. Они также идентифицировали и описывали эмбрионы с нарушением анатомического развития и экспрессии генов (т. е. предполагаемых мутантов).

Для преподавателей в учебных заведениях, которые еще не располагают необходимым оборудованием или где средства на развитие лабораторий и обновление учебных программ ограничены, финансовые затраты на реагенты и аппаратуру могут стать значимым фактором, равно как и время и усилия, требуемые от преподавателя независимо от условий работы. Тем не менее, мы утверждаем, что использование WISH в подобной учебной лабораторной среде может обеспечить важную связь между генетикой развития и анатомией. По мере развития технологий и того, как изучение развития организма на молекулярном уровне становится проще, дешевле и все более популярным, многие эволюционные биологи, экологи и физиологи обращаются к исследовательским стратегиям в области молекулярной биологии. Использование WISH в рамках лабораторного курса сравнительной биологии позвоночных является одним из примеров того, как молекулярные методы и анатомия могут быть объединены в одном курсе. Это дает студентам старших курсов колледжей возможность освоить современные методы биологических исследований, что способствует получению более разностороннего образования и стимулирует будущие междисциплинарные научные исследования.

Протокол

1. Плазмиды Преобразование целевых кДНК

Часть I: Преобразование плазмиды

(Необходимое время: 3 часа плюс ночной инкубации)

  1. Теплый SOC питательный бульон в 42 ° С водяной бане (500 мкл на реакцию)
  2. Оттепель компетентных клеток на льду
  3. Добавить 1 мкл плазмиды до 25 мкл компетентных клеток
  4. Место на льду в течение 20 минут
  5. Теплового шока клеток в 42 ° С водяной бане в течение 45 секунд
  6. Сразу же месте клетки на льду в течение 2 минут
  7. Добавить 500 мкл 42 ° C питательный бульон для каждого флакона клетки
  8. Встряска при 37 ° С в течение 2 часов при 255 оборотах в минуту (RPM)
  9. Пластина 75 мкл смеси преобразование Лурия Бертани (LB) пластин агара
  10. Инкубируйте пластин перевернутой при температуре 37 ° С в течение ночи

Часть II: Е. кишечной культуры

(Необходимое время: 15 минут плюс ночной инкубации)

  1. Для каждой реакции, аликвоту 3 мл LB бульоне и 3 мкл 50 мг / мл ампициллина в пробирку
  2. Очистите 1 бактерий колонии от агара тарелку и добавить в каждую пробирку
  3. Встряхните культуры труб при 37 ° С при 255 оборотов в минуту ночь

Часть III: плазмиды Prep

(Необходимое время: 1,5 часа)

  1. Изолировать плазмиды овернайт культур в 5 премьер FastPlasmid Kit Mini (Catalog # 2300000)
  2. Чтобы проверить наличие подготовленных плазмиды, запустить ДНК вымывают из комплекта на 1% Трис-ацетат-ЭДТА (TAE) гель окрашивали бромидом этидия

2. В Ситу DIG-меченых зондов Синтез РНК

Часть I: Линеаризация плазмиды

(Необходимое время: 2,5 часа)

  1. В трубке микроцентрифужную 1,5 мл, сочетать:
    Подготовлено плазмиды 20 мл
    * Ограничение ферментов 2 мл
    Буфер ** 10 мл
    10X бычьего сывороточного альбумина (БСА) 10 мл
    Диэтиловый Pyrocarbonate (DEPC) вода 58 мл
    100 мл
  2. Инкубировать при 37 ° С в течение 2 часов
    * Зависит от плазмиды
    ** Зависит от рестрикции

Часть II: Транскрипция

(Необходимое время: 3 часа)

  1. В трубке микроцентрифужную 1,5 мл, сочетать:
    Линейные плазмиды 4 мл
    10X Буфер Транскрипция ** 4 мл
    Дигоксигенин Этикетка Mix 4 мл
    Полимеразная * 2 мл
    Ингибитор РНКазы 2 мл
    DEPC воды 24 мл
    40 мл
  2. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа
  3. Добавьте 2 мкл полимеразы *
  4. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа
  5. Добавьте 2 мкл ДНКазы
  6. Инкубировать при 37 ° С в течение 20 минут
    * Зависит от плазмиды
    ** Зависит от полимеразы

Часть III: Осадки

(Необходимое время: 5 минут плюс 2 часа инкубации в течение ночи, 1 час к центрифуге и повторно приостанавливать)

  1. Добавьте 4 мкл 0,2 М ЭДТА
  2. Добавьте 5 мкл 4М хлорида лития
  3. Добавить 150 мкл ледяной 100% этаноле
  4. Инкубируйте при -80 ° С в течение 2 часов ночи
  5. Центрифуга при 14000 оборотов в минуту в течение 30 минут при температуре 4 ° С, переливать от надосадочной
  6. Сухие гранулы в течение 7 минут
  7. Повторное приостановить в 20 мкл воды DEPC
  8. Инкубировать при 37 ° С в течение 5 минут

Часть IV: Фракционирование - выполняет только тогда, когда зонд размером свыше 0,6 кб

(Необходимое время: варьируется в зависимости от размера зонда, как правило, не более 20 минут)

  1. В трубке микроцентрифужную 1,5 мл, сочетать:
    РНК-зонд 20 мл
    DEPC воды 12 мл
    Бикарбонат натрия 4 мл
    Карбонат натрия 4 мл
    40 мл
  2. Инкубируйте в 60 ° С водяной бане. База времени инкубации по уравнению:
    Время (мин.) = (начиная кб - желаемый кб) / (0,11 х, начиная кб х желаемого кб)
    Средний желаемый размер = 0,6 кб

Часть V: Заключительные осадков

(Необходимое время: 5 минУтес плюс 2 часа инкубации в течение ночи, 1 час к центрифуге и повторно приостанавливать, 1 час для гель-электрофореза)

  1. Добавить 40 мкл DEPC воды
  2. Добавить 8 мкл ацетата натрия
  3. Добавить 1,04 мкл ледяной уксусной кислоты
  4. Добавить 240 мкл ледяной 100% этаноле
  5. Инкубируйте при -80 ° С в течение 2 часов ночи
  6. Центрифуга при 14000 оборотов в минуту в течение 30 минут при температуре 4 ° С, переливать от надосадочной
  7. Сухие гранулы в течение 7 минут
  8. Повторное приостановить в 20 мкл воды DEPC
  9. Vortex смешивать
  10. Чтобы проверить наличие riboprobe, запустите повторно приостановил решение на 1% гель окрашивали бромистым TAE этидия

3. Всего в гору гибридизация

Часть I: Фиксация зародышей и протеиназы К Пищеварение

(Необходимое время: Fix ночью плюс 4 часа следующего дня для хранения, 2,5 часа из хранилища Часть II)

  1. Сбор поставил данио эмбрионов и зафиксировать в 4% параформальдегида (PFA) в течение ночи при температуре 4 ° C
  2. Вымойте фиксированных эмбрионов в фосфатном буферном растворе, содержащем 0,1% Твин-20 (PBST) 3 раза в течение 10 минут каждый
  3. Для обеспечения воздействия эмбрионов экспериментальных реагентов, вручную dechorionate эмбрионов (при необходимости), используя с острым концом щипцов
  4. Дегидрировать эмбрионов путем промывки в градуированных серии по 25% и 50% метанола в PBST в течение одного часа каждый мыть, затем хранить в 100% метаноле при -20 ° C
  5. Когда все будет готово к использованию, увлажняет эмбрионов в PBST промывкой в ​​50% (2 раза) и 25% (1 раз) метанола в PBST в течение 10 минут каждый. Наконец мыть 2 раза в течение 10 минут каждый на 100% PBST. Точные сроки не важно для PBST / метанол моет
  6. Bleach эмбрионов в 10% раствор перекиси водорода в PBST, при необходимости, удалить темные пигменты. Эмбрионы должны инкубировать в раствором перекиси водорода в течение 10-20 минут, в зависимости от возраста эмбриона, и шапка микроцентрифужную трубка должна оставаться открытой, чтобы предотвратить наращивание давления воздуха
  7. Дайджест эмбрионов с 50 мг / мл протеиназы К разбавленным 1:5000 в PBST за 3-15 минут, в зависимости от возраста эмбриона
  8. Повторное исправление эмбрионов в 4% PFA в течение 30 минут, а затем промыть 3 раза в PBST в течение 5 минут каждый

Часть II: Гибридизация Riboprobes

(Необходимое время: 3 часа плюс ночь для гибридизации, 1,5 часа на следующий день в часть III)

  1. Prehybridize эмбрионов с prehybridization решение (PHS) в предварительно разогретой до 70 ° С на водяной бане 2-3 часа
  2. Удалить PHS, добавить 0,5 мл раствора гибридизации и 1,5 мкл ранее синтезированных меченых дигоксигенин riboprobes, инкубировать при температуре 70 ° С в течение ночи. Температура может колебаться в пределах нескольких градусов в зависимости от целевой riboprobe
  3. На следующий день, мыть эмбрионов при 70 ° С в градуированных растворов 75%, 50% и 25% PHS в 2х физиологическим раствором цитрата натрия (SSC) в течение 10 минут, затем промыть в 0,2 x SSC в течение 30 минут при 68 ° C
  4. Стирать в Малеиновый буфера кислота (МАБ) 2 раза в течение 10 минут каждый при комнатной температуре

Часть III: Anti-дигоксигенин (α-DIG) Антитела Инкубационный

(Необходимое время: 3 часа плюс ночь, чтобы блок, 2,5 часа на следующий день в часть IV)

  1. Трансфер эмбрионов на 12-луночного планшета
  2. Предварительно блок эмбрионов в 1-2 мл блокирующий раствор в течение 3 часов при комнатной температуре
  3. Одновременно, предварительно блок антител путем подготовки второго тома блокирующий раствор и разбавления анти-дигоксигенин антител 1:2000 в этом растворе
  4. Удалите предварительно блока и добавить 1-2 мл предварительно заблокировали α-DIG решение, инкубировать в течение ночи при 4 ° С
  5. На следующий день, мыть эмбрионов в МАБ. Разрешить эмбрионов для инкубации в МАБ в течение 5 минут, а затем выполнять буфера изменений и инкубировать в течение 10 минут два, один 30-минутный и один 60-минутный интервал. Точные сроки не нужно
  6. Вымойте эмбрионов 3 раза по 5 минут каждый в щелочной фосфатазы (AP) буфера

Часть IV: Окрашивание и Окончательная обработка

(Необходимое время: 1 час, чтобы на ночь для окрашивания, в зависимости от riboprobe использоваться, 4 часа до начала глицерина моет, 6-10 часов в глицерина мыть, можно хранить в глицерине)

  1. Добавьте 1-2 мл красящим раствором, чтобы эмбрионы, заверните в фольгу пластину и проверьте окрашивания регулярно (примерно каждые 20 минут), пока окрашивание достаточно
  2. Промыть эмбрионы с PBST 2 раза по 5 минут каждый, чтобы остановить реакцию окрашивания
  3. Дегидрировать эмбрионы, используя 10 минут моет в 25% (1 раз) и 50% (2 раза) метанола в PBST, то в 100% метанола, для удаления фона окрашивание
  4. Разрешить эмбрионов для инкубации в 100% метанола в течение 2 часов при комнатной температуре
  5. Увлажняет в PBST использованием 10 минут моет в 50% (2 раза) и 25% (1 раз) метанола в PBST, затем промыть в 100% PBST 2 раза
  6. Передача окрашенных электроннойmbryos на 80% глицерин в PBST, с помощью градуированных серии моет, и хранить при температуре 4 ° C.

Рецепты:

  • LB агаром-10 г LB агар + 250 мл дистиллированной воды, автоклав, когда прохладный на ощупь добавить 250 мкл ампициллин, залить 15-20 мл теплого раствора в каждую чашку Петри, агар позволяют укрепить
  • LB-бульон 12,5 г LB бульоне + 200 мл дистиллированной воды, автоклав, дать остыть, прежде чем использовать
  • 1% TAE геля 0,4 г агарозы, 40 мл 1X TAE, 2 мкл бромистого этидия; нагрузка 7 мкл плазмиды (плазмиды Преобразование целевых кДНК) или 3 мкл riboprobe и 4 мкл DEPC воды (на месте DIG-меченых зондов Синтез РНК) + 1 мкл красителя погрузки, 5 мкл лестницы ДНК
  • Prehybridization решение-50% формамида, 5X SSC, 9.2 мм лимонной кислоты, 1% Твин-20
  • Гибридизация решение-prehybridization решение плюс 500 мкг / мл тРНК и 50 мкг / мл гепарина
  • МАБ-100мм малеиновой кислоты, 150 мМ NaCl, 0,2 М NaOH, 0,1% Твин-20, рН до 7,5
  • Блокировка Решение-3 частей МАБ, 1 часть 10% Boehringer блокирующий реагент в МАБ, 1 часть тепла отключены ягненка сыворотке
  • AP-60мм буфера Трис-HCl, рН 9,5, 60 мм NaCl, 30 мм MgCl 2, 0,1% Твин-20
  • Окрашивание Решение-5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат (BCIP) и Nitro тетразолия (НБТ) в буфере А. П.

4. ПРЕДСТАВИТЕЛЬ РЕЗУЛЬТАТЫ

При правильном выполнении реакции между НБТ, BCIP и щелочной фосфатазы образуют фиолетовый осадок, который должен появиться на эмбрион полосатого данио, как фиолетовые пятна. Riboprobes должны быть предварительно синтезированных из кДНК соответствующие гена. Таким образом, можно сделать вывод, любое пятно представляет визуализировать области полосатого данио, в котором интерес гена была переписана в этом конкретном этапе развития. Для целей данного курса riboprobes были синтезированы из aldh1a2 (ранее raldh2; Бегеманн и др., 2001;. Рис. 1); fgf8a (Reifers и др., 1998;. Рис. 2); deltaC (Оутс и др., 2005.); MyoD1 (Вейнберг и др., 1996.); shha (. Краусс и др., 1993), pax2a (Brand и др., 1996;. рис. 3) и myl7 (ранее cmlc2;. Yelon и др., 1999) кДНК. Окрашивание ожидалось в средней линии и в анатомических структур, включая сомитов, tailbud, myotome, мозг и сердце. Ace/fgf8a мутантов, как ожидается, имеют дефекты во многих из этих структур. Окрашивание было легко визуализированы с использованием стандартного рассекает микроскопом. Дополнительные источники содержат больше информации и устранение неполадок на WISH методы, подобные описанным здесь (Clark, 2003;. D'Коста и др., 2009; Schmoldt и др., 2009;. Schoenwolf, 2009).

Рисунок 1
Рисунок 1. Данио эмбриона через 24 часа после оплодотворения, которая была гибридизации с riboprobes специфичные для aldh1a2. Специфическое окрашивание можно увидеть в глазах, задний мозг, почки грудного плавника зачатков, и сомитов. Передняя является верхней, задней находится на дно.

Рисунок 2
Рисунок 2. Данио эмбриона на 13 сомитов этап развития, который был гибридизации с зондом, специфичные для fgf8a. Специфическая окраска наблюдается в конечном мозге, спинном промежуточный мозг, средний мозг, задний мозг границы, сомитов, а tailbud. Брюшной находится слева, спинной находится справа.

Рисунок 3
Рисунок 3. 22 часа после оплодотворения эмбрион полосатого данио, которая была гибридизации с riboprobe специфичные для pax2a, надежный маркер полезны для визуализации нервной системы. Специфическое окрашивание можно увидеть в сосудистое трещина, средний мозг, задний мозг границы, слухового пузырька, и спинной нейронов мозга. Спинной зрения с впереди слева.

Обсуждение

ЖЕЛАЕМ был использован в сравнительных Биология лаборатории позвоночных, чтобы помочь учащимся понять роль генетики в анатомическом развития через визуализацию известных моделей экспрессии генов. Для первой части курса студенты осуществляется вскрытия на организмы, представляющих несколько различных таксонов хордовых, что позволяет им достаточно времени, чтобы изучить, понять, сравнить, и анатомии позвоночных контраст.

В качестве введения второй части курса студенты были даны формальные лекции описывающих развитие данио и анатомии. Методы и ожидаемые результаты WISH эксперимента были также обсуждены. Студенты затем давали жить данио на сомитогенеза и чопорная-6 стадий развития, и на 2 и 5 дней после оплодотворения (DPF) для изучения под микроскопом вскрытии. Это должно было дать студентам лучше понять, что данио эмбрионы выглядят и типов морфологических изменений, которые происходят в течение онтогенеза.

В следующей сессии лаборатории, студенты получили эмбрионы рыбок данио, в которой желание было ранее выполнялись. Им было предложено изучать и описывать закономерности экспрессии генов для каждого гена (riboprobe используется). Эмбрионы для WISH были получены из вязки между членами гетерозиготных линий ace/fgf8a. На основании менделевской наследование, 25% эмбрионов из вязки ace/fgf8a должны были быть гомозиготной мутантов и проявлять дефектов во многих анатомических структур особое внимание в этом курсе. На основе опубликованных отчетов и неопубликованные наблюдения в Albertson лаборатории, дефекты головного мозга и неправильное цикла сердца ожидали, а также дефекты в сомитов (Brand и др., 1996;. Albertson и Yelick, 2005; личных наблюдений).

Студентам было предложено, чтобы изучить все образцы, дикого типа (гетерозиготных животных неотличимы от диких братьев и сестер типа на ранних стадиях развития) и гомозиготных мутантов, для каждого шаблона экспрессии генов представлены. Затем их попросили написать лаборатории доклады с описанием их результаты, и на основе их знания анатомии и генетики, как дефектных генов, возможно, осажденный анатомических пороков развития.

Студенты, казалось, получить эту лабораторию упражнение с волнением и любопытством. Большинство из них никогда не использовал WISH до и были крайне заинтересованы в этой части курса. Студенты обнаружили различные модели экспрессии генов в эмбрионах данио интригующим, а некоторые даже описаны модели окрашивания визуализированы, ассоциируя их с известными дизайн и символы, такие как смайлик. В результате отчеты лаборатории показали студенты общее понимание протокола желание и экспрессии генов в специфических анатомических структур. Студенты также должны были понимать специфические функции генов изучены с помощью WISH в лаборатории (Стикни и др., 2000;. Huelsken и др., 2002;. Гита-Loganathan и др., 2008a;.. Гита-Loganathan и др., 2008b ). Видно было, однако, что некоторые студенты имели ограниченные знания фоне сигнальных путей и гены, имеющие интерес. Более подробную информацию об этих понятиях в WISH вводная лекция может быть полезным дополнением к использованию WISH в будущем Сравнительный курсы биологии позвоночных.

Так как протокол обычно занимает от четырех дней подряд, в зависимости от графика, конечно, студенты могут только быть в состоянии завершить часть эксперимента в классе и инструктор должен нести ответственность за оставшуюся часть. В нашей сравнительной биологии позвоночных класса, студенты завершили окрашивание реакции в лаборатории, в то время как ассистент выполнили все предыдущие шаги. Если он предпочитал иметь студенты выполняют WISH в классе, протокол может быть разделена на подразделения, которые могут быть выполнены в течение нескольких сессий лаборатории, в зависимости от сроков класса. Если это не возможно для студентов, чтобы выполнить весь протокол, так как он был здесь в связи с лабораторией встреча только раз в неделю, студенты могут добавить красящим раствором в начале класса и, в зависимости от riboprobe используются, имеют полное окрашивание в течение часа. Время, необходимое для окраски развиваться значительно варьируется с каждым riboprobe и различных экспериментальных условиях, и должны быть заранее определены до начала занятий. Примечательно, что если студенты будут только развивающихся пятно в лаборатории, преподаватели будут отвечать за все предыдущие шаги, которые потребуют значительного времени и усилий за пределами классной комнаты. При желании, короче альтернатива WISH может быть иммуногистохимии с использованием антител, этикетки для визуализации белка локализации, однако в это время, данио-специфические антитела для развития гены не являются легкодоступными. Другим вариантом было бы выполнять WISH на различные виды позвоночныхой у студентов сравнить картин экспрессии тех же генов у разных организмов (Pizard и др., 2004;. Арамаки и др., 2007;. Новые модельных организмов, 2008; Новые модельных организмов, 2010).

Главной целью использования в WISH Сравнительный курс биологии позвоночных было продемонстрировать студентам, как молекулярно-биологические методы используются для изучения анатомического развития. Она также предоставила возможность для студентов размышлять о том, как изменить экспрессию генов может привести не только к пороки развития, но и эволюционные изменения. Формализованные как эволюционная биология развития (часто упоминается как "Evo-Devo"), этой быстро развивающейся области исследований должна стать связующим звеном генотип и фенотип за счет развития, а также для выяснения потенциальных баз механистической эволюционных изменений. С появлением этой области, более экологи, организменном биологов, физиологов и применяют молекулярные методы в своих исследованиях. Мы утверждаем, что использование WISH в сравнительной курс биологии позвоночных поможет сохранить программу в курсе текущих технологических и концептуальных достижений в области исследований, а также способствовать лучшему горизонтального выравнивания верхней курсы биологии уровня путем объединения биологических полей. Более того, это интегративный подход обеспечит студентам возможность учиться ассортимент биологических методов исследования в один курс, что приводит к более диверсифицированной образования и содействие перспективным междисциплинарных научных исследований.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность биологический факультет Сиракузского университета и доктор Мэрилин Керр за их роль в управлении Сравнительный курс биологии позвоночных. Albertson лаборатории поддержан грантом R21DE019223 из Национального института здоровья / Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований, а также предоставлять R01AG031922 из Национального института здоровья / Национальный институт по проблемам старения.

Материалы

  • Автоклав
  • Микро-центрифуга
  • 37 ° C инкубатора (с шейкером)
  • 4 ° С микро-центрифуга
  • Водяная баня
  • Вихревой
  • Аппарат Гель-электрофорез
  • -20 ° C морозильника
  • -80 ° С морозильной камерой
  • Рокер / шейкер
  • 4 ° C холодильник
  • Пройдя через микроскоп (желательно с экрана обучения или камеры)

Ссылки

  1. Albertson, R. C., Yelick, P. C. Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton. Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).
  2. Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).
  3. Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. J., Geisler, R., Ingham, P. W. The zebrafish neckless mutation reveals a requirement for raldh2 in mesodermal signals that pattern the hindbrain. Development. 128, 3081-3094 (2001).
  4. Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., Nüsslein-Volhard, C. Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain. Development. 123, 179-190 (1996).
  5. Clark, M. In situ Hybridization: Laboratory Companion. , Wiley-VCH. (2003).
  6. D'Costa, A., Shepherd, I. T. Zebrafish development and genetics: Introducing undergraduates to developmental biology and genetics in a large introductory laboratory class. Zebrafish. 6, 169-177 (2009).
  7. Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 1. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2008).
  8. Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2010).
  9. Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M. Wnt signaling in limb organogenesis. Organogenesis. 4, 109-115 Forthcoming.
  10. Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M., Huang, R., Christ, B. Wnt signaling in somite development. Ann Anat. 190, 208-222 Forthcoming.
  11. Huelsken, J., Behrens, J. The Wnt signaling pathway. J Cell Sci. 15, 3977-3978 (2002).
  12. Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
  13. Oates, A. C., Mueller, C., Ho, R. K. Cooperative function of deltaC and her7 in anterior segment formation. Dev. Biol. 280, 133-149 (2005).
  14. Pizard, A., Haramis, A., Carrasco, A. E., Franco, P., López, S., Paganelli, A. Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2004).
  15. Reifers, F., Bohli, H., Walsh, E. C., Crossley, P. H., Stainier, D. Y., Brand, M. Fgf8 is mutated in zebrafish acerebellar (ace) mutants and is required for maintenance of midbrain-hindbrain boundary development and somitogenesis. Development. 125, 2381-2395 (1998).
  16. Schmoldt, A., Forecki, J., Hammond, D. R., Udvadia, A. J. Exploring differential gene expression in zebrafish to teach basic molecular biology skills. Zebrafish. 6, 187-199 (2009).
  17. Schoenwolf, G. C. Laboratory Studies of Vertebrate and Invertebrate Embryos: Guide and Atlas of Descriptive and Experimental Development. , 9th Edition, Pearson Education- Benjamin Cummings. Upper Saddle River, NJ. (2008).
  18. Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. Somite development in zebrafish. Dev Dyn. 219, 287-303 (2000).
  19. Weinberg, E. S., Allende, M. L., Kelly, C. S., Abdelhamid, A., Murakami, T., Andermann, P., Doerre, O. G., Grunwald, D. J., Riggleman, B. Developmental regulation of zebrafish MyoD in wild-type, no tail and spadetail embryos. Development. 122, 271-280 (1996).
  20. Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Dev. Biol. 214, 23-37 (1999).

Перепечатки и разрешения

Теги

Fgf8aNbt BcipK
Использование Всего горе На месте Гибридизация в ссылку молекулярной биологии и организменном
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.