Разделение Бусы и клетки в Многоканальные Устройства микрожидкостных Использование Диэлектрофорез и ламинарного потока

Summary

Диэлектрофорез (DEP) является эффективным методом для манипулирования клеток. Печатные платы (PCB) может обеспечить недорогой, повторного использования и эффективной электродов для бесконтактного манипуляции ячейки в микрожидкостных устройств. Объединив PDMS основе микрожидкостных каналов с покровные на печатных платах, мы демонстрируем шарик и клеточной манипуляции и разделения внутри многоканального микрожидкостных устройств.

Abstract

Микрожидкостных устройств Advanced Cell исследования, предоставляя динамические жидкостный среды в масштабе ячейки для изучения, обработки, сортировки и подсчета клеток. Однако, манипулируя ячейки в жидкостный по-прежнему остается проблемой и требует сложных протоколов изготовления для формирования клапана и электроды, или требования специальности оборудования, например, оптический пинцет. Здесь мы показываем, что обычных печатных плат (PCB) может быть использован для бесконтактного манипулирования клетки, используя диэлектрофореза (DEP) для бортовых и клеточных манипуляций в областях ламинарного потока для bioactuation, так и для клеток и шарик разделения в многоканальных микрожидкостных устройств. Во-первых, мы представляем протокол для сборки электродов и DEP микрожидкостных устройств, а также подготовку клеток для DEP. Затем, мы характеризуем DEP работы с полистирола. Наконец, мы показываем репрезентативные результаты из бисера и клеточной разделение в многоканальных микрожидкостных устройств. Таким образом, DEP является эффективным методом для манипулирования частицами (бусы или клеток) в микрожидкостных устройств.

Protocol

Общая схема оборудования установки показана на рисунке 1А. PCB-образец сборка более подробно в поперечном сечении схему на рисунке 1b.

1. Подготовка печатной платы Электроды:

1. Дизайн печатной платы электродов желаемого геометрии для создания неоднородного электрического поля. Индивидуальные электрода печатной платы чипы можно заказать через коммерческие объекты производства (рис. 1в).
2. Подготовка сборных PCB электродов пайки 16 мм, провод к концу каждого печатного металлический электрод (рис. 1D).
   1. Место проволокой на конце электрода. Держите провод в месте на металл площадь печатной платы с горячим паяльником к теплу проволоки.
   2. Поток небольшое количество припоя в нагретой проволокой, чтобы заполнить проволоки припоя.
   3. После проволоки заполнена припоя, удалите паяльник, держа провод на месте, пока припой остынет.
3. Повторите процесс пайки для каждого электрического соединения на печатной плате (рис. 1D).

2. Подготовка микрожидкостных каналов:

1. Полидиметилсилоксан (PDMS)-основанной микрожидкостных каналов готовятся с использованием эластомера PDMS, Sylgard 184 от компании Dow Corning. Мастер плесень который определяет каналы обычно создается с помощью стандартных процессов микротехнологий использованием кремниевой пластины и СУ-8 фоторезиста.
2. Смешайте базы соединения отвердитель в соотношении 10:1 в течение 5 минут.
3. Вылейте жидкость PDMS на сборные SU-8 мастер формы и удалить пузырьки воздуха, подвергая жидкость PDMS в вакууме в течение нескольких минут. Повторите вакуумного процесса, если это необходимо, чтобы полностью удалить все пузырьки.
4. Cure PDMS при 70 ° С в течение 2 часов.
5. Удалить PDMS плита с микрожидкостных каналов из пластины с лезвием, стараясь не сломать пластины.
6. Удар отверстия для введения жидкости и клеток в микрожидкостных устройств. (Примечание: Шприц накачки, тяжести или поверхностного натяжения основан потока могут быть использованы с DEP.)
7. Осмотрите микрожидкостных устройств для обеспечения его от пыли и мусора. Очистка PDMS можно легко достигается с помощью магии 3M Scotch Tape.
8. Плазменные связь PDMS микрожидкостных каналов чистой No.0 толщины (80-130 мкм) покровным. Тепло-покровное микрожидкостных сборки при 100 ° С в течение минимум 15 мин.

3. Подготовка низкой проводимостью СМИ:

1. С низкой проводимостью СМИ получают путем смешивания 8,5% сахарозы + 0,3% глюкозы (м / о) в деионизированной (DI) воде. ¹
   Примечание. Ранее мы показали, что клетки могут быть культивировали в течение суток в обычных СМИ культуру клеток после воздействия низкой проводимостью в течение короткого периода (примерно 30 мин) ¹¹

4. Соберите микрожидкостных каналов на электроды PCB:

1. Нанесите небольшое количество (примерно 10 мкл) минерального масла на печатной плате для обеспечения плотного контакта между печатной платой и покровное.
   Примечание: необязательный шаг для уменьшения электрода визуализации является покрытие поверхности печатной платы с очень тонким слоем черной перманентным маркером или краской.
2. Место покровное-микрожидкостных каналов сборки на смазанный печатной платы, с покровным формирования контакта с маслом (покровное вниз). Аккуратно нажмите покровное-микрожидкостных сборки вниз, чтобы обеспечить хороший контакт и свести к минимуму пузырьки воздуха, которые могут отвлекать от клеток и шарик визуализации. Примером законченное устройство показано на рис 1D.

5. Сортировка и концентрат Бусы и ячеек с помощью DEP:

1. Заполните микрожидкостных каналов DI водой или с низкой проводимостью средствах массовой информации; процесс плазменной связей способствует легкой загрузки водных растворов в микрожидкостных каналов, временно делая обычно гидрофобной поверхности гидрофильных PDMS.
2. Ввести клеток и / или полистирола в канал водохранилища (рис. 1в). Здесь мы используем человеческой аденокарциномы толстой кишки (HT-29) клеток.
3. Подключите выход функции генератора на вход усилителя переменного тока, а затем подключить выход усилителя к электроду проводов. Обложка все электрические провода и поверхностей установки изоляционной лентой для защиты пользователей от потенциального воздействия током. Схема оборудования установки показана на рисунке 1А.
4. Установите функцию генератора для получения выходной синусоидальной волны 1,0-1,5 МГц. Амплитуда вывод должен быть настроен для усилителя мощности РФ для получения вывода 80-100В на печатной плате. Усилитель ВЧ мощности в этой работе требуется входное напряжение около 220-330 мВ. Для отдельных клеток и бусы, скорость ламинарного потока должна быть совместимой с DEP силы двигаться клетки и бусы в основной канал (ширина W = 100 мкм, высота Н = 27 мкм) в целевых каналов (ширина W = 100 мкм , высота Н = 27 мкм).
   Внимание: проконсультируйтесь с производителем печатной платы для определения мнапряжений aximum операционной, чтобы избежать таких вопросов, как PCB перегрева или плавления. Проверьте спецификации производителей оборудования для генератора функции и производители усилителей мощности, чтобы определить безопасные настройки операционной.
5. Инициировать DEP для сортировки клеток и бисером. Клетки опыт положительно DEP в то время как полистирол бусин опыт отрицательный-DEP в неоднородном электрическом поле в указанных частотах. Это позволяет DEP силы активированных bioactuation и разделения клеток и других частиц в микрожидкостных устройств с помощью доступных и многоразовые ПХД в качестве электродов.

6. Представитель Результаты:

Когда DEP является эффективным при исполнительных клеток или частиц, надежная выравнивание в неоднородном электрическом поле наблюдается для статических ванны или медленный скоростей жидкости. В условиях больших скоростей жидкости, клетки или частицы поведение зависит от относительной ориентации осевой поток электрического поля и скорости потока. Кроме того, клетки и частицы поведения также зависит от напряженности электрического поля и степень неравномерности в электрическом поле. Типичное поведение клеток или частиц включать "жемчужину цепи," езда на велосипеде, срыва или поворота.

Условия, которые компромисс или отменить DEP включают наличие солей или других ионных молекул в жидкости, слабые электрические поля, чрезмерной скорости потока, покровные, которые являются слишком толстыми, или проводящих решений между покровным и ПХД электродов (например, трещины покровное может индуцировать смешивание воды и нефтепродуктов).

Здесь, при использовании No.0 толщина покровных (80-130 мкм) и расстояние между электродами из (231 мкм), градиент квадрата напряженности электрического поля, приложенного к НТ-29 клеток и бисером, по оценкам, от 2 до ^-8 до 6 ^-8 V ² / мкм ^{3 1.}

Сила DEP можно оценить, измеряя скорость частицы, манипулируют DEP в статическом жидкости (рис. 2А-B). Из-за малой инерционности частиц и вязкие среды микрожидкостных каналов, гидродинамическая сила сопротивления будет равна, но в противоположном направлении с силой DEP. Средняя скорость в шарик с низкой проводимостью СМИ составляет 34,5 мкм / с с поддержкой DEP напряжение 93 В пик-пик и 1,5 МГц. Гидродинамическая сила сопротивления может быть вычислена по следующей формуле ^1.

F = _{перетащить} 6πηRv

Средняя вязкость η-за низкой проводимости среды при 20 ° С 1,27 мПа • с и шарик радиуса составляет 7,5 мкм. Гидродинамическая сила сопротивления для полистирола Microbead оценивается в 6,19 рп. Чтобы продемонстрировать способность приводить в бисер микрожидкостных каналов (рис. 2C-F), мы инициировали поток с низкой проводимостью средств массовой информации за счет использования поверхностного натяжения опосредованного потоком. Средняя скорость в бусину одного входного канала был 1540 мкм / сек, в то время как средняя скорость в пределах отдельных каналов была снижена до 565 мкм / сек (рис. 2С). Инициируя DEP, бусины были сохранены в центральном канале, а не выбрасывается в сторону канала. Таким образом, в этих условиях, DEP сил было достаточно, чтобы преодолеть силы трения жидкости в двух каналах стороны.

Тот же принцип был использован, чтобы отвлечь бусы из центральных Каннел к одному каналу стороны, просто меняя ориентацию каналов и шарик потока, что и DEP электроды (рис. 2E-F). По рыбалки металлический электрод на стороне одного канала на входе, когда DEP был инициирован, бисером руководствовались в сторону канала как бисер подходил трифуркации точки. Там, DEP сил было достаточно, чтобы вытащить бусины в одной из боковых каналов, где ламинарным потоком продолжает двигать их вниз канала (рис. 2F).

Поскольку клетки и полистирола имеют четкие различия в их способности быть поляризованы и приводиться в неоднородных электрических полей, мы используем DEP, чтобы продемонстрировать способность выполнять на-чипе разделение клеток и бусы, одновременно. Мы использовали те же структуры микрожидкостных каналов и печатных плат электродов в соответствии с настройками на рисунке 2E-F, но вводить суспензию НТ-29 клеток и бусин с низкой проводимостью средств массовой информации в одном канале входе (рис. 3). Когда DEP вводится, и в этих условиях, HT-29 клетки были сохранены в двух левых выходных каналов в то время как бусины были сохранены в отдельный выходной канал справа. Здесь клетки показывают поведение характерно "жемчужно-цепочки", как они собираются в левый канал выхода. Иногда бусины и клеточной привязываться вместе, в котором они собираются вместе, часто в каналы ячейки вывода. Из этого экспериментадр. данные, мы определяем сортировки ставке, которая будет 713 частиц (клеток и бисером) в минуту, что эквивалентно 14 260 клеток и бисером за 20 минут. Число клеток и бисером получить, является актуальным и полезным для молекулярной биологии, работы с изображениями, биохимических и лаборатории-на-чипе приложений.

Рисунок 1. На основе ПХБ DEP клеток и частиц в микрожидкостных каналов. () Настройки оборудования для DEP основе срабатывания начинается с функцией генератора для определения частоты и амплитуды электрического сигнала, то усилитель для повышения сигнала электрические поля, создаваемого на печатной плате. (B) микрожидкостных сборки устройства для образца срабатывания состоит из PDMS каналов микрожидкостных необратимо связана с нет. 0 толщина покровного (80-130 мкм) с помощью кислородной плазмы, не проводящих средах купаться клеток и / или бисером. (C) PCB электродов, используемых здесь состоят из двух регионов, где электроды штыревой для создания строгого неоднородном электрическом поле. (D) завершили устройства: печатная плата с trifurcated микрожидкостных устройств на одном покровное, вставке показаны все устройство с электродами проводов. (CD) для масштаба, PCB измерения 8,4 см (л), 2,1 см (ш), с 5 мм широкий электродов.

Рисунок 2. Представитель изображений клеток и бусы в каналах до и во время срабатывания DEP. () 15 мкм флуоресцентного бисера полистирола в низкой проводимостью СМИ решение в PDMS микрожидкостных каналов, без ламинарного потока (время, прошедшее, 1,23 сек). (B) По DEP инициации, бисером мигрируют к электроду PCB моделей (черные полосы), а не между электродами (время, прошедшее, 8,18 сек). (C) Бисер в те же каналы под ламинарным потоком разделены между тремя отдельными каналами (время, прошедшее, 5,3 сек), а когда начинается DEP (D), бусины приводятся течь только в центральном канале (время, прошедшее, 4.3 сек). (Е) Изменяя ориентацию каналов на плату электродов, бусины могут быть дифференциально направленную в сторону каналов (F) с помощью DEP, а не центральный канал, как показано на (D). (EF) Время, прошедшее в 8,23 сек и 5,16 сек соответственно. Все масштабе баров = 100 мкм.

Рисунок 3. Представитель изображений клеток и бусы в каналах до и во время срабатывания DEP. (АВ) До начала DEP, смешанный раствор человеческой аденокарциномы толстой кишки (HT-29) клетки и бисером потока с одного канала на 3 отдельных выходных каналов. Открытая стрелка указывает направление потока ламинарный и каналов изложены пунктирными линиями для ориентации и разъяснения. (CD), вызывая DEP, бусы и клетки избирательно приводом на отдельные каналы, как это определено. HT-29 клетки выхода центрального и левого канала в то время как бусины выход правого канала. Характеристика сцепления жемчужина из бисера и клеток наблюдается при срабатывании DEP. (А, С) Дифференциальная интерференционного контраста изображения клеток и бусы в микроканалов оказывает бисером легко видимыми. Glow масштаба интенсивность изображения (B, D) одного и того же DIC изображений (А, С) улучшения визуализации клеток в каналах. Отражающими металлическими электродами ((А, С) светлая полоса и (B, D) желтый и зеленый) обеспечивают заметным ориентиром для выравнивания микроканалов на электроды для эффективного DEP основе срабатывания. Шкала бар = 100 мкм.

Discussion

Сотовые манипуляции в микрожидкостных устройств желательно для сортировки или селективное размещение отдельных клеток или для популяционных исследований. ² ламинарного потока используется в сочетании с клапанами и насосами для манипулирования клеток в микрожидкостных устройств. Однако, эти методы сами по себе являются сложными и требуют детального процессов изготовления и навыки ³ Центрифугирование может упростить требования к размещению клетки, но одновременные снимки является вызовом;. Кроме того, канал архитектура для центрифугирования должны быть тщательно учитывая при проектировании желаемого манипуляций и с учетом эффектов центростремительных сил. ⁴ Лазерный пинцет может быть использована для сотовых размещения, но метод является дорогостоящим и не поддается на высокой пропускной сортировки клеток ^5. Тем не менее, DEP было продемонстрировано, как эффективная система "электрический пинцет" для эффективного размещения клетке, характеристика и манипуляции. ^6,7

В частности, DEP был использован для выборочного захвата и сортировки клеток для на-чипе обработки живых и мертвых клеток, ^7-10 и для сбора клеток на резонансных датчиков для измерения клеточной массы. ¹¹ Ранее мы показали, что за счет увеличения DEP силы на бактерии или бусы выше жидкостный силы сопротивления, на-чипе концентрации и захвата полистирола и Listeria моноцитогенес V7 может быть достигнуто ^12. Смешанные популяции E. палочки и L. моноцитогенес бактерии могут быть также направлены и выпустили через импульсы DEP. Кроме того, более крупные частицы могут быть дифференциально захватили и сосредоточился на электроды на основе большого размера частиц, в то время как более мелкие частицы, не захвата, а удаляются с жидкостный поток. ¹³ Когда DEP силы не преодолевают жидкостный перетаскивания сил на частицы, бусинка или ячейка не захватили, а переехал в жидкостный поток. Как показано на рис 2С, бусины могут быть сосредоточены в центральной части потока жидкости достаточно сохранить бусины в центральный канал. Это может быть связано с совместным действием частицы к частице влияний в электрическом поле, жидкость скоростей, превышающих скорость DEP перетаскивания сил, сочетание этих или других непредсказуемый эффект.

Новейшие достижения в области бесконтактных DEP позволяет максимально захватить клетку и манипуляции с минимальным обязательным полем, защищая таким образом типы клеток, в наибольшей степени, во время манипуляций DEP. ^1,9 Бесконтактные DEP открывает перспективы для сообщества микрофлюидики для сортировки, сбора и позиционирования клетки в микрожидкостных устройств. Мы ожидаем, что с ростом спроса на, и реализация, DEP для манипуляций в микрожидкостных устройств, дальнейших открытий и инноваций позволит расширить понимание и влияние сил DEP.

ПХБ могут быть изготовлены за счет высоких объемов процессов по доступной цене с быстрым сроки выполнения работ изготовления, что делает их хорошей платформой для коммерциализации. Кроме того, ПХБ просты в использовании и доступным для ученых в ряду дисциплин для на-чипе ячейки манипуляции и сортировки.

При проектировании расположения электродов PCB, внимание должно быть уделено частиц требуемого / элемент траектории. Ключевыми факторами для рассмотрения включают размер частиц и тип (шарик и / или ячейки), тип клеток, микроканальных размер, скорость потока, расстояние между электродами (которая определяет напряженность электрического поля), покровное толщины и жидкости проводимости. Эти факторы влияют силы, необходимой и доступной для манипулирования частицы или клетки, и в конечном итоге эффективность сепарации. Наш протокол, представленные здесь демонстрирует эффективную установку для начала DEP для микросфер и клеточной сепарации. Для потенциальных приложений, пользователей должна соответствовать архитектуре микрожидкостных дизайн канала требуемый расход пути для клеток и бусы, а также электродов моделей для оптимизации эффективности для каждого приложения. Расстояние электрода и толщины покровного могут быть использованы в соответствии с ранее сообщалось рекомендации при проектировании макета микрожидкостных канала ^1.

Проводимость и диэлектрическая проницаемость клеток / частиц и окружающей среды должна отличаться достаточно, чтобы способствовать положительным или отрицательным DEP, сохраняя при этом клетки нетронутыми. Полярность DEP для сферической частицы можно определить из действительной части комплекса значение следующего Клаузиуса-Mosotti фактор на частоте ω напряжения DEP.

Уравнение 1

В этом уравнении ε, является проницаемость, σ есть проводимость, ε * является комплексной диэлектрической проницаемости. Индексы р и мобозначают частицы и средств массовой информации, соответственно. Когда клетка имеет более высокую диэлектрическую проницаемость, чем средства массовой информации, или действительная часть Клаузиуса-Mosotti фактором становится положительной, частица становится более поляризованным, чем окружающий среды. Из-за неоднородном электрическом поле, поляризация частицы становится неоднородным, и это создает положительный DEP (+ DEP) группировка, которая ячейки в область с более высокой напряженности электрического поля. Если ячейка имеет более низкую диэлектрическую проницаемость, чем окружающие СМИ или действительная часть Клаузиуса-Mosotti фактором становится отрицательной, она будет проходить отрицательный DEP (-DEP), и клетка вынуждена к минимальным регионе области. Если клетки и средств массовой информации имеют примерно одинаковый комплексной диэлектрической проницаемости, никакая сила не может быть создан для работы клеток. По этой причине, чистая вода является предпочтительным СМИ для манипуляции частиц DEP. Однако, чтобы избежать осмотического стресса на клетку от чистой воды, низкой проводимостью СМИ была сформулирована сохранить проводимость без изменений, но и увеличить осмолярность для уменьшения осмотического стресса в клетках. Обычные культуры клеток или физиологических буферы, такие как DMEM или PBS, имеют высокую проводимость, которая не подходит для манипуляций DEP.

Кроме того, мы ранее показали, что клетки могут быть захвачены на датчики с DEP использованием низкой проводимости среды. После краткого периода для сотовых вложения, низкая проводимость СМИ могут быть заменены на необходимые средства массовой информации клеточной культуры для поддержки роста клеток в течение нескольких дней ^11.

Исходя из нашего опыта, люминесцентные бусины очень яркие по отношению к живой флуоресценции клетки, таким образом это может быть проблемой, чтобы соответствовать бусинка интенсивности к интенсивности живой клетки и флуоресцирующих. Для улучшения визуализации обеих клеток и бусы, мы использовали DIC микроскопии на прямой микроскоп для работы с изображениями, и другое. Для отображения клеток и бусы, мы представили данные в интенсивности свечения масштаба изображения, которая сохраняет данные в широком спектре цветов для более удобного просмотра. Таким образом, при проектировании изучение интересов, визуализация параметров и ресурсы должны быть рассмотрены.

Таким образом, мы демонстрируем возможность избирательно приводить бисером и клеток в отдельных каналов с помощью DEP. С ростом полезности микрожидкостных каналов клеточной биологии, биохимии и биотехнологии приложений, DEP является желательным вариантом для мобильного сбора, размещения и сортировки. Изготовление печатных плат электродов является недорогим и удобным, электроды проста в использовании, и быстрым временем изготовления идеально подходят для реализации DEP.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 kit (PDMS)	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Dow Corning Sylgard
16 awg соединительный провод	Belden	8521	(Тип MW) Mil-W-76C-PVC
Золотая печать Cover Glass	Ted Pella, Inc.	260320	No. 0 толстый, 24 x 60 мм
Miltex Biopsy Punch	VWR international	95039-104	Miltex, различные размеры Изготовленные
заказ электроды для печатных плат	Схемы Bay Area Circuits	Нестандартные детали
Минеральное масло	Fisher Scientific	O121-1
Деионизированная вода	Дом DI водоснабжение	Нет	Использование фильтрованной DI воды
D-глюкоза безводная Гранулированный AR	Mallinckrodt Baker Inc.	4912-06
Сахароза, Кристал	Маллинкродт Бейкер Инк.	8360-06
Флуоресцентные полимерные микросферы	Bangs Laboratories	FS07F/9277	15μ m Дракон зеленый микросфера
HT-29 клеточная линия	ATCC	HTB-38D	Аденокарцинома толстой кишки
человека Typsin 0,05% ЭДТА	Invitrogen	25300054
Eclipse E600FN вертикальный микроскоп	Nikon Instruments	Eclipse E600FN
Phantom V310 Высокоскоростная камера визуализации	Phantom	V310
BX51 вертикальный исследовательский микроскоп	Olympus Corporation	BX51
SpotFlex цветная камера высокого разрешения	Диагностические приборы	FX1520
Генератор функций	Agilent Technologies	3325A
RF усилитель мощности	EIN	2100L