Методы визуализации биолюминесценции бактериальных инфекций в живых животных, описаны. Патогенные изменен, чтобы выразить люциферазы позволяет оптическим целого изображения тела инфекций у животных. Экспериментальные модели на животных могут быть инфицированы люциферазы выражения патогенов и в результате течения заболевания визуализированы в реальном времени биолюминесценции изображений.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Использование люциферазы в Изображение Бактериальные инфекции у мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Визуализация представляет собой ценный метод, который может быть использован для мониторинга биологических процессов. В частности, в режиме реального времени в живых животных можно отслеживать присутствие раковых клеток, стволовых клеток, специфических типов иммунных клеток, вирусных патогенов, паразитов и бактерий 1-2. Применение биолюминесцентной визуализации в изучении патогенов имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными стратегиями анализа инфекций на моделях животных3-4. Инфекции можно визуализировать в отдельных животных в динамике, что исключает необходимость проведения эвтаназии для определения локализации и количества патогена. Оптическая визуализация позволяет провести комплексное исследование всех тканей и органов, а не только отбор проб из участков, которые ранее были известны как инфицированные. Кроме того, точность инокуляции в конкретные ткани может быть определена непосредственно перед началом эксперимента, что позволяет исключить животных, в которых инокуляция прошла неудачно. Можно контролировать вариабельность между животными, так как визуализация позволяет индивидуально наблюдать за каждой особью. Визуализация обладает потенциалом значительно сократить количество необходимых животных благодаря возможности получения данных в многочисленных временных точках без необходимости забора тканей для определения бактериальной или вирусной нагрузки3-4.
В данном протоколе описаны методы визуализации инфекций у живых животных с помощью биолюминесцентной томографии для рекомбинантных штаммов бактерий, экспрессирующих люциферазу. Люциферазы щелкуна (CBRLuc) и светляка (FFluc) используют люциферин в качестве субстрата5-6. Свет, излучаемый как CBRluc, так и FFluc, имеет широкий диапазон длин волн от 500 nm до 700 nm, что делает эти люциферазы отличными репортерами для оптической визуализации на моделях живых животных7-9. Это обусловлено прежде всего тем, что для предотвращения поглощения гемоглобином и, следовательно, эффективного прохождения через ткани млекопитающих требуются длины волн более 600 nm. Люцифераза генетически вводится в бактерии для генерации светового сигнала10. Для мониторинга инфекции в режиме реального времени биолюминесцентные бактерии вводят мышам интратрахеально для инокуляции легких. После инъекции люциферина изображения регистрируют с помощью системы визуализации IVIS. Во время визуализации мыши анестезируют изофлураном с использованием системы газовой анестезии XGI-8. Анализ изображений позволяет локализовать и количественно оценить источник сигнала, что соответствует месту(ам) бактериальной инфекции и количеству бактерий соответственно. После визуализации проводят определение КОЕ в гомогенизированных тканях для подтверждения наличия бактерий. Для корреляции количества бактерий с интенсивностью люминесценции используют несколько доз бактерий. Визуализацию можно применять для изучения патогенеза, а также для оценки эффективности антибактериальных соединений и вакцин.
Протокол
1. Легочная инфекция при интубации трахеи
- Взвесьте мышей и, дополнительно, отмечает могут быть сделаны на уши для облегчения идентификации.
- Обезболить мышей с кетамином (100 мкг на грамм веса мыши) и ксилазина (10 мкг на грамм веса мыши) путем внутрибрюшинного заражения.
- Место мышей в клетках до полной анестезии. Сожмите подушечки ног и проверить педали рефлекс. Мыши должны проявить уменьшена или не рефлекторную реакцию.
- Место мыши на интубации стоять лежать на спине.
- Fix резинкой на интубацию стоять, а затем поместить его под верхние резцы мыши. Используйте ленту, чтобы исправить ноги и руки на интубации стенда.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хотя следующие протоколы, как правило, приводят к высоким качеством изображения, важно учитывать несколько ключевых вопросов, чтобы получить точные и согласованные данные из изображений исследований. Люминесценция изображения должны быть приобретены, которые насчитывает от 600 до 60000, чтобы сигнал выше фона и камера не насыщен. Если сигнал, полученный меньше 600 от условий эксплуатации должны быть приспособлены для увеличения рассчитывает. Если сигнал, получаемый составляет более 60 тысяч камер насыщается в некоторых .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Исследования на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Институциональные уходу и использованию животных комитета Техас & M University.
Благодарности
Авторы выражают благодарность Cirillo лаборатории членов за ценные обсуждения и помощь на протяжении всего этого исследования. Мы благодарим доктора Джошуа Хилл и лаборатории д-р Джеймс Сэмюэль за помощь во время съемок этого протокола. Эта работа финансировалась грантом 48523 от Фонда Билла и Мелинды Гейтс и предоставить AI47866 из Национального института здоровья.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Изофлуран | VETONE | 501027 | |
| Кетамин | Butler Animal Health Supply | ||
| Ксилазин | MP Biomedicals | 158307 | |
| Люциферин | GMT | LUCK-100 | |
| Раствор Fetal plus | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
| Катетер (22G x 1”) | Terumo Medical Corp. | OX2225CA | |
| Проводник | Hallowell EMC | 210A3491 | |
| Октоскоп со спекулумом | Hallowell EMC | 000A3748 | |
| Система Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | ||
| Система газовой анестезии XGI-8-gas | Caliper Life Sciences | ||
| Программное обеспечение Living Imaging | Caliper Life Sciences | ||
| Прозрачные носовые конусы | Caliper Life Sciences | ||
| Светоотражающий разделитель | Caliper Life Sciences |
Ссылки
- Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
- Hutchens, M., Luker, G. D.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
