Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Использование люциферазы в Изображение Бактериальные инфекции у мышей

20.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2547

⸱

18 февраля 2011 г.

 ,  , 
1Microbial & Molecular Pathogenesis, Texas A&M Health Science Center

В этой статье

Краткое содержание

Методы визуализации биолюминесценции бактериальных инфекций в живых животных, описаны. Патогенные изменен, чтобы выразить люциферазы позволяет оптическим целого изображения тела инфекций у животных. Экспериментальные модели на животных могут быть инфицированы люциферазы выражения патогенов и в результате течения заболевания визуализированы в реальном времени биолюминесценции изображений.

Аннотация

Визуализация представляет собой ценный метод, который может быть использован для мониторинга биологических процессов. В частности, в режиме реального времени в живых животных можно отслеживать присутствие раковых клеток, стволовых клеток, специфических типов иммунных клеток, вирусных патогенов, паразитов и бактерий 1-2. Применение биолюминесцентной визуализации в изучении патогенов имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными стратегиями анализа инфекций на моделях животных3-4. Инфекции можно визуализировать в отдельных животных в динамике, что исключает необходимость проведения эвтаназии для определения локализации и количества патогена. Оптическая визуализация позволяет провести комплексное исследование всех тканей и органов, а не только отбор проб из участков, которые ранее были известны как инфицированные. Кроме того, точность инокуляции в конкретные ткани может быть определена непосредственно перед началом эксперимента, что позволяет исключить животных, в которых инокуляция прошла неудачно. Можно контролировать вариабельность между животными, так как визуализация позволяет индивидуально наблюдать за каждой особью. Визуализация обладает потенциалом значительно сократить количество необходимых животных благодаря возможности получения данных в многочисленных временных точках без необходимости забора тканей для определения бактериальной или вирусной нагрузки3-4.

В данном протоколе описаны методы визуализации инфекций у живых животных с помощью биолюминесцентной томографии для рекомбинантных штаммов бактерий, экспрессирующих люциферазу. Люциферазы щелкуна (CBRLuc) и светляка (FFluc) используют люциферин в качестве субстрата5-6. Свет, излучаемый как CBRluc, так и FFluc, имеет широкий диапазон длин волн от 500 nm до 700 nm, что делает эти люциферазы отличными репортерами для оптической визуализации на моделях живых животных7-9. Это обусловлено прежде всего тем, что для предотвращения поглощения гемоглобином и, следовательно, эффективного прохождения через ткани млекопитающих требуются длины волн более 600 nm. Люцифераза генетически вводится в бактерии для генерации светового сигнала10. Для мониторинга инфекции в режиме реального времени биолюминесцентные бактерии вводят мышам интратрахеально для инокуляции легких. После инъекции люциферина изображения регистрируют с помощью системы визуализации IVIS. Во время визуализации мыши анестезируют изофлураном с использованием системы газовой анестезии XGI-8. Анализ изображений позволяет локализовать и количественно оценить источник сигнала, что соответствует месту(ам) бактериальной инфекции и количеству бактерий соответственно. После визуализации проводят определение КОЕ в гомогенизированных тканях для подтверждения наличия бактерий. Для корреляции количества бактерий с интенсивностью люминесценции используют несколько доз бактерий. Визуализацию можно применять для изучения патогенеза, а также для оценки эффективности антибактериальных соединений и вакцин.

Протокол

1. Легочная инфекция при интубации трахеи

  1. Взвесьте мышей и, дополнительно, отмечает могут быть сделаны на уши для облегчения идентификации.
  2. Обезболить мышей с кетамином (100 мкг на грамм веса мыши) и ксилазина (10 мкг на грамм веса мыши) путем внутрибрюшинного заражения.
  3. Место мышей в клетках до полной анестезии. Сожмите подушечки ног и проверить педали рефлекс. Мыши должны проявить уменьшена или не рефлекторную реакцию.
  4. Место мыши на интубации стоять лежать на спине.
  5. Fix резинкой на интубацию стоять, а затем поместить его под верхние резцы мыши. Используйте ленту, чтобы исправить ноги и руки на интубации стенда.
  6. Аккуратно переместите tougue из уст использованием щипцов.
  7. Вставьте зеркало с octoscope внутри рта и ротоглотки смотреть в гортань до открытия видна.
  8. Advance проводник покрытый cathether в трахею, пока catether концентратор на резцы. Удалить проводник. Положите воздуха в cathether наблюдать груди расширения и подтверждения правильности интубации.
  9. Inject 50 мкл бактериальной (в показанного на рисунке мы использовали Кальметта Герена (БЦЖ), выражающая нажмите жук красный люциферазы (CBRLuc), построенный в нашей лаборатории, но любая люминесцентного бактериального штамма может быть использован) раствор через cathether использованием 1 мл шприца.
  10. Место мыши в клетке, и наблюдать его во время восстановления после анестезии.

2. Обезболивания животных и подготовка к биолюминесценции изображений

Мыши под наркозом с использованием изофлуран XGI-8 Газ Aneshesia системы.

  1. Перед началом работы XGI-8 анестезии системы, взвешивать каждый угольный фильтр канистры и писать вес и дата на нем. Если вес составляет 50 грамм в течение от первоначального веса, замените его новым канистру.
  2. Проверьте изофлуран уровня в испарителе и заполнить его в случае необходимости.
  3. Включите эвакуации насоса в передней части XGI-8 анестезии системе и настроить до 8 литров в минуту (литров в minuite).
  4. Включите кислорода из цилиндра высокого давления и установить его на 55 фунтов на квадратный дюйм.
  5. Включите кислорода переключения (зеленый) на передней XGI-8 анестезии системы.
  6. Включить подачу газа изображения камеры, чтобы установить уровень потока газа. Установить до 0,25 литров в минуту, а затем выключить газовый поток.
  7. Включите потока газа в камеру вводного наркоза, чтобы установить уровень потока газа. Установить до 1,5 литров в минуту, а затем выключить газовый поток.
  8. Включите изофлуран с испарителем и настроен на 2-2,5 процента. Изофлуран уровня могут быть скорректированы в зависимости от количества животных используются и вес.
  9. Место мышей в индукции камеру и закрыть крышкой. Включить подачу газа индукции камеры. Место мышей в камере в течение 5 - 10 minuites, пока они не обезболить полностью.
  10. Применение оптических мазь для глаз, чтобы защитить мышь глаз во время съемки и место мышей в камере изображений в одном из головных частей на анестезию многообразия. Используйте легкую перегородку между мышами, чтобы предотвратить отражение света на соседние предметы животного.
  11. Inject люциферин (150 мкг / г веса тела) путем внутрибрюшинного заражения.

3. Биолюминесценция изображений

  1. Запустите программу Жизнь Imaging.
  2. Если в системе не инициализирована, инициализации системы ИВИС Imaging.
  3. Установите параметры для работы с изображениями, щелкнув последовательность установки в панели управления ИВИС приобретения.
    Выберите люминесценции и фотографии в режиме Imaging. Если возможность осуществлять DLIT 3D реконструкции требуется, выберите фотографические, люминесцентные и структурных свет картинки как часть последовательности изображений.
    Установить время экспозиции от 0,5 сек до 10 минут.
    Установить Биннига и F / остановка на основе ожидаемой яркости образца.
    Установить фильтр для возбуждения блока и выбросов фильтр, чтобы открыть, если только планирует приобрести только определенные длины волн света. В случае DLIT 3D конституцию, установить несколько фильтров излучения с различными длинами волн позволяют точно определять локализацию источника.
    Установить FOV от А до D в зависимости от количества мышей или регион животных для включения в образ. Выберите и В в течение 1 мышь, С в течение 2-3 мышей и D в течение 4-5 мышей.
  4. Нажмите кнопку Добавить в Image Wizard в панели управления Приобретение добавить последовательность установки.
  5. Начало отображающей последовательности, нажав приобрести.
    В случае строительства DLIT 3D, люминесцентные изображения будут приобретены за несколько фильтров излучения на разных длинах волн. Фото-и структурированный свет изображения также будут приобретены.
  6. Во время приобретения изображений и редактирования изображений уровней панели будут видны. Заполните также подробную информацию насколько это возможно для каждого эксперимента в редактировать изображения для обеспечения легкого отслеживания изображения на более позднее время и сохранять изображения.
  7. ReRemove мышей от ИВИС изображения камеры и вернуть их в клетках. Соблюдайте восстановлениеэстезия обеспечить мышей не были существенно затронуты процедурой. Животные должны быть под постоянным контролем, пока они полностью восстановиться от анестезии (обычно 1-2 мин).

4. Бывших естественных изображений и КОЕ анализа для количественного бактерий в легких

  1. Inject мышей с люциферин внутрибрюшинно в том же порядке, как для работы с изображениями, только до эвтаназии.
  2. Усыпить мышей при введении препарата в дозе 100 мг / кг pentobarbitol 5 мин после инъекции люциферин.
  3. Эксплантов легкие от мышей и поместить в стерильный Петри, блюда с использованием стерильного пинцета и ножниц.
  4. Место Петри-блюдо с эксплантированных орган в области обработки изображений камеры и приобрести биолюминесценции изображения так же, как и для целого мыши.
  5. После обработки изображений, удалять эксплантированных органа из чашки Петри использованием стерильных щипцов и гомогенизации в 1 мл PBS.
  6. Сделать разведения и пластины ткани на соответствующих селективных средах. Усредненные ткани могут быть сохранены -80 ° C для повторного покрытия в случае необходимости. Кроме того, гомогенизированные ткани могут быть использованы для РНК или ДНК добычи количественно бактериального чисел КПЦР.

5. Анализ люминесценция изображений

  1. Старт "Программное обеспечение Жизнь изображений" и просматривать файлы изображений.
  2. Используйте "Палитра инструментов" для регулировки изображения. Нажмите Настройка изображения, изменять коррекции / параметры фильтрации и мин / макс для отдельных шкал цвета.
  3. Используйте ROI инструментов в выпадающем списке для количественной оценки интенсивности света. Выберите ROI форма, количество и размер. Перетащите ROI кадр область интереса на изображении. Убедитесь, что все ROI имеют одинаковый размер и форму. Нажмите ROI измерения и сохранять, копировать и / или экспорт количественных данных.
  4. В случае DLIT 3D реконструкции, нагрузка последовательность изображений, включая структурированные изображения света. Нажмите топографии поверхности в инструмент Платт. В раскрывающемся списке, щелкните вкладку Реконструкция для создания рельефа поверхности. Поверхности беспорядок появится в окне.
  5. Выберите DLIT 3D реконструкции в инструмент Платт. В выпадающем списке, перейдите на вкладку Свойства установить свойства тканей и источник спектра. Мышцы рекомендуется в большинстве случаев. В раскрывающемся списке, щелкните вкладку анализ, чтобы выбрать длину волны для анализа. Щелкните вкладку Параметры и подтвердите значения по умолчанию или настроить параметры DLIT если это необходимо. Щелкните вкладку реконструкция начать 3D анализ.
  6. Когда 3D-реконструкция закончится, 3D вид будет отображать результаты 3D-реконструкции. Нажмите результатов вкладку, чтобы увидеть анализ данных по плотности фотонов, вокселей и DLIT параметры алгоритма.
  7. Сохранить и / или экспорт результатов анализов 3D реконструкции в цифры и файлов данных.

6. Представитель Результаты:

Биолюминесценции изображения мышей, инфицированных бактериями биолюминесцентного вместе с неинфицированными управления мышью, показаны на рисунке 1. Мышей легочная инфицированных биолюминесцентного бактерии производят значительный сигнал от легких (рис. 1). Интенсивность люминесценции количественно, как полный поток в пределах ROI (область заинтересована) (рис. 2). Количественные данные об интенсивности света нормирован для колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий, полученных из легких, чтобы подтвердить, что сигнал вырабатывается из биолюминесценции бактерий и может быть по сравнению с отрицательным контролем. Расположение и интенсивность сигнала может быть дополнительно проанализировать DLIT 3D-реконструкция люминесценции источник на основе томографии мышью поверхности 11. Эти анализы позволяют количественного и локализации биолюминесцентного сигнала производится. Результаты 3D-реконструкция люминесцентный источник в зараженных мышей показывает, что свет изготавливается из легких мыши (рис. 3). Бывший изображений естественных условиях в результате мыши легких подтверждают, что свечение излучается из легких, а не некоторые связанные с сопоставляются ткани или органа (рис. 2С).

Рисунок 1
Рисунок 1. Люминесценция визуализации легких зараженных мышей с биолюминесценции бактерий с меткой CBRluc. Неинфицированные управление мышью находится на левой и два инфицированных мышей справа. Мыши были заражены бактериями выражения CBRluc (п = 2) через трахею маршрута. Через 10 минут после инъекции люциферин, люминесценция изображения были получены в течение 10 мин при 4 позиции: спинной, брюшной, левая сторона и правая сторона.

Рисунок 2
Рисунок 2. Количественной интенсивности света от мышей, инфицированных бактериями выражения CBRluc. (А, В) Люминесценция образы ROI анализ и количественно суммарный поток света от ROI в спинной и брюшной позиции, соответственно. Неинфицированных мышей слева и два инфицированных мышей справа. Люминесценция изображения были получены из легких ое мышей неинфицированных и инфицированных CBRlux (п = 2). Интенсивность света вокруг легких была количественно путем анализа ROI. C), исключая виво изображения легких от неинфицированных (вверху) и инфицированных (внизу два ряда легких) у мышей. Люциферин вводили 5 miniuts до эвтаназии и изображения были затем приобретены. Количественные значения нормированы на КОЕ.

Рисунок 3
Рисунок 3. 3D-реконструкция биолюминесценции источника (ов) от легочной инфицированные мыши. Мышь была заражена бактериями выражения CBRluc по интратрахеального инъекции. Последовательности изображений было приобретено с использованием различных фильтров выбросов серийного длин волн от 540 нм до 700 нм. Последовательности изображений было использовано для восстановления 3D для люминесценции источник в животное предметов, содержащих структурированные мнимой. ) Томографии для мыши показан в различных положениях: спереди, сзади, слева и справа. Источники света, показаны как вокселей (красные коробки внутри мыши 3D), которые находятся в легких, как это определено реконструкции. Б) Фотон densiy карту измеренных и модельных данных. Сравнение измеренных и моделирование кривых плотности фотонов предоставить информацию о качестве реконструкции. Хорошее качество реконструкции результата в подобных измеряется и моделирование фотонных плотностей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Хотя следующие протоколы, как правило, приводят к высоким качеством изображения, важно учитывать несколько ключевых вопросов, чтобы получить точные и согласованные данные из изображений исследований. Люминесценция изображения должны быть приобретены, которые насчитывает от 600 до 60000, чтобы сигнал выше фона и камера не насыщен. Если сигнал, полученный меньше 600 от условий эксплуатации должны быть приспособлены для увеличения рассчитывает. Если сигнал, получаемый составляет более 60 тысяч камер насыщается в некоторых ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Исследования на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Институциональные уходу и использованию животных комитета Техас & M University.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Cirillo лаборатории членов за ценные обсуждения и помощь на протяжении всего этого исследования. Мы благодарим доктора Джошуа Хилл и лаборатории д-р Джеймс Сэмюэль за помощь во время съемок этого протокола. Эта работа финансировалась грантом 48523 от Фонда Билла и Мелинды Гейтс и предоставить AI47866 из Национального института здоровья.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ИзофлуранVETONE501027
КетаминButler Animal Health Supply
КсилазинMP Biomedicals158307
ЛюциферинGMTLUCK-100
Раствор Fetal plusVortech Pharmaceutical Ls, Ltd
Катетер (22G x 1”)Terumo Medical Corp.OX2225CA
ПроводникHallowell EMC210A3491
Октоскоп со спекулумомHallowell EMC000A3748
Система Xenogen IVISCaliper Life Sciences
Система газовой анестезии XGI-8-gasCaliper Life Sciences
Программное обеспечение Living ImagingCaliper Life Sciences
Прозрачные носовые конусыCaliper Life Sciences
Светоотражающий разделительCaliper Life Sciences

Ссылки

  1. Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).
  2. Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
  3. Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).
  4. Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).
  5. Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors. Science. 244, 700-702 (1989).
  6. Wet, J. R. de, Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).
  7. Hastings, J. W. Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review. Gene. 173, 5-11 (1996).
  8. Zhao, H. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).
  9. Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
  10. Contag, C. H. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).
  11. Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).
  12. Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

IVIS3D
Использование люциферазы в Изображение Бактериальные инфекции у мышей
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.