Методическая статья

Клоногенных Пробирной: прилипшие клетки

DOI:

10.3791/2573

⸱

13 марта 2011 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Epigenomic Medicine, BakerIDI Heart and Diabetes Institute, The Alfred Medical Research and Education Precinct, 2Department of Pathology, The University of Melbourne, 3Epigenetics in Human Health and Disease, BakerIDI Heart and Diabetes Institute, The Alfred Medical Research and Education Precinct, 4Department of Anatomy and Cellular Biology, The University of Melbourne

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Применимость анализа клоногенных для оценки репродуктивной жизнеспособности была создана более 50 лет. Здесь мы показываем, общий порядок выполнения анализа клоногенных с прилипшие клетки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клоногенных (или колониеобразующих) анализа была создана более 50 лет; оригинальная статья, описывающая метод был опубликован в 1956 году 1. Помимо документального метода, первоначальное исследование ориентиром создается при первом радиационно-дозовой кривой для рентгеновских облученных млекопитающих (HeLa) клеток в культуре 1. В принципе, анализ клоногенных позволяет оценить различия в репродуктивных жизнеспособность (способность клеток к воспроизведению потомства, то есть одну ячейку, чтобы сформировать колонию 50 и более клеток) между контролем необработанных клетках и клетках, которые подверглись различные методы лечения, такие как воздействие ионизирующего излучения, различные химические соединения (например, цитостатики), либо в других случаях генетических манипуляций. Анализа стал наиболее широко принятый метод в области радиационной биологии и широко используется для оценки радиационной чувствительности различных клеточных линий. Кроме того, анализ клоногенных обычно используется для мониторинга эффективности излучения изменения соединений и для определения эффектов цитотоксических агентов и других противораковых терапии на колониеобразующих способности, в различных клеточных линий. Типичный выживания клоногенных эксперимент с использованием сторонником линии клетки включает в себя три отдельных компонента, 1) лечение клеточный монослой в колбах культуре тканей, 2) подготовка одного суспензии клеток и покрытие соответствующее число клеток в чашках Петри и 3) установление и окрашивание колонии Следующие соответствующего периода инкубации, которые могут варьироваться от 1-3 недель, в зависимости от клеточной линии. Здесь мы показываем, общий порядок выполнения анализа клоногенных с приверженцем клеточные линии с использованием увековечены кератиноцитов человека клеточной линии (FEP-1811) 2. Кроме того, наши цели, чтобы описать общие черты анализов клоногенных в том числе расчет эффективности покрытий и выживания фракций после контакта клеток к радиации, и примером модификации радиационно-ответ с использованием природных формулировка антиоксидант.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культуры клеток и экспериментальной установки

  1. Кератиноциты человека, учитываются в качестве монослоев в 75 см 2 культуре ткани колбы, содержащие 15 мл кератиноцитов-SFM (К-SFM) среде (GIBCO, бессывороточной среде) с добавлением L-глютамина (2 мМ), эпидермальный фактор роста (5 нг / мл), бычий гипофизарный экстракт (40 мкг / мл) и 20 мг / мл гентамицина. Клетки, выращенные в увлажненном 5% CO 2 среде при температуре 37 ° C.
  2. Клетки высевают на 12 х 25 см 2 культуре ткани колбы, содержащие 5 мл K-SFM среды.

Одноместный клеточные суспензии готовят трипсинизации. Клетки промывают фосфатным буферным раствором и инкубировали с 0,05% трипсин / ЭДТА решение в течение 5-10 минут. Когда клетки начинают становиться округлыми и ~ 30% из них индивидуальный 3-х томах модифицированных Дульбеко орел среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки добавляют для нейтрализации трипсина. Клетки отделяются с помощью пипетки вверх и вниз (20 раз). Клетки подсчитывают использованием гемоцитометра.

Соответствующие номера сотовых высевают в зависимости от времени удвоения клеточной линии (примерно 20 часов для человека FEP-1811 кератиноцитов). Целью является достижение ~ 90% слияния (~ 10 6 клеток на колбу) на день эксперимента.

Эксперимент, состоящий из 12 колб является оптимальным для одного анализа клоногенных (шесть необлученного контроля и шести облученных колбы), которые могут быть завершены примерно в четыре часа.

2. Лечение и облучения

  1. Лечить клеток для соответствующего времени с соответствующим изменением радиационно-соединения и подвергать клетки воздействию ионизирующей радиации или γ-излучения или рентгеновских лучей.

Обычно шесть колб служить покрытие эффективность (без лечения) и наркотиков только контролирует. Остальные шесть колб облучении.

В этом примере кератиноцитов человека лечатся с различной концентрацией Cinnulin PF (СПЛ; Integrity нутрицевтики International, Спринг Хилл, Теннесси, США; репрезентативные данные по 20 мкг / мл показано ниже), растворимый в воде природный антиоксидант формулировка, за 1 час при 37 ° C. Клетки облучают 4 Гр использованием 137 Cs источника (Gammacell 1000 Elite облучателя; Nordion International, ON, Канада, 1,6 Гр / мин).

3. Обшивка

  1. После лечения, один клеточные суспензии получаются как описано выше.
  2. Количество клеток в каждом образце считаются тщательно используя гемоцитометра и разводят так, что соответствующие номера сотовых высевают в чашки Петри (пять повторов каждый на 15 мм, посуда).
    Покрытие эффективности и / или доли выживших следует ожидать при принятии решений количество клеток для семян на чашку. Целью является достижение диапазоне от 20 - 150 колоний.

Чашки Петри расположены в увлажненной пластиковые окна клонирования и инкубировали в 5% CO 2 окружающей среды на 37 ° С для образования колоний.

Инкубационный период для образования колоний варьирует от 1-3 недель для различных клеточных линий, считается, что время должно быть эквивалентно по крайней мере шесть клеточных делений. В этом примере, контроль блюда для кератиноцитов человека требуется восемь дней сформировать достаточно большой клонов, состоящих из 50 и более клеток.

4. Фиксация и окрашивание колонии

Выполните следующие действия в вытяжном шкафу.

  1. Аккуратно снимите СМИ от каждой из пластин аспирации.
  2. Промыть каждую тарелку с 5 мл 0,9% физиологического раствора.
  3. Fix колонии с 5 мл 10% нейтральный буферный формалин решение в течение 15-30 минут.
  4. Пятно с 5 мл 0,01% (м / о) кристаллический фиолетовый в дН 2 O в течение 30-60 минут.
  5. Вымойте избыток фиолетового кристалла с дН 2 O и позволяют блюда для просушки.

5. Подсчет колоний

Стереомикроскоп

  1. Колонии, содержащие более 50 отдельных клеток считаются использованием стереомикроскопа.

Цифровые изображения и подсчета использования для обработки изображений

  1. Цифровые изображения из колонии полученные с помощью камеры или сканера
  2. Колонии подсчитывают использованием изображений анализа программных пакетов, как описано ниже.

Сотовые подсчета использованием ImageJ (Фиджи Версия 1.44a)

  1. Откройте файл изображения на Фиджи, перейдите в меню Файл -> Открыть.
  2. Если необходимо преобразовать изображение в 8-битном формате, перейдите в Image -> Adjust ...-> Threshold.
  3. Отрегулируйте порог на снижение уровня неспецифической фоновом режиме, так что только колонии обнаружено.
  4. Граф колоний, используя следующие: переход к процессу -> двоичный -> Найти максимумов.

Для этого изображения формата, шум толерантности может быть установлена ​​в 0. Убедитесь, что облегченный вариант фона помечены иПредварительный просмотр обнаружены максимумы, чтобы убедиться, что все клеточные колонии были правильно зарегистрированы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом примере человека FEP-1811 кератиноцитов лечили различные концентрации до 100 мкг / мл СПЛ; данные будут показаны на 20 мкг / мл СПЛ в течение 1 часа при температуре 37 ° C. После лечения клетки облучали 4 Гр использованием 137 Cs источника (Gammacell 1000 Elite облучателя; Nordion International, ON, Канада, 1,6 Гр / мин). Для контроля необработанных и наркотиков только лечение 100 клеток высевали в каждой чашке Петри и 1000 клеток на чашку высевают для облученных образцов. Как указано в таблице выше, к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поддержке австралийского Института ядерной науки и техники не будет подтверждено. TCK был удостоен AINSE наград. Эпигеномном Лаборатории медицины при поддержке национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (566 559). HR поддерживается австралийской аспирантуре и BakerIDI ярких наград искры. Эта работа финансируется за счет CRC для биомедицинской визуализации Development Ltd (CRC-BID), созданы и поддерживаются в совместную программу исследований австралийского правительства центров. СО является получателем австралийской аспирантов награду и CRC-BID дополнительные стипендии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Кератиноцитарно-сывороточная среда без питательныхInvitrogen17005042с добавлением 2mM L-глютамина, 20μ г/мл гентамицина, эпидермального фактора роста, экстракта гипофиза крупного рогатого скота.
Трипсин-ЭДТАИнвитроген15400-0540,05% трипсин/ЭДТА для отделения адгезивных клеток; 10 шт., разведенных в PBS без Ca2+/Mg2+.
Дульбекко s модифицированная эфирная средаСреда для ростаInvitrogen11885-084Дополнена 10% FBS и 20μ г/мл гентамицина; используется для нейтрализации трипсина/ЭДТА.
0,09% солевойрастворИспользуется для промывания колоний.
10% нейтральный буферный раствор формалинаРаствор Sigma-AldrichHT501128~4% формальдегида; используется для фиксации колоний.
Кристаллический фиолетовыйпорошокSPI Supplies02577-MB0,01% раствор кристаллического фиалки, приготовленный в dH2O, используется для окрашивания колоний.
Гаммаселл 1000 элитный облучательNordion International Inc.
чашки Петри60 х 15 ммFalcon BD353002
гемоцитометромHawksley; Медицинское и лабораторное оборудованиеAC1000
Cloning boxПластиковый ящик с отверстиями, пробитыми на противоположных сторонах крышки; для хранения чашек Петри при длительной инкубации для образования колоний.
СтереомикроскопТип 102ПриборыИспользуется для подсчета колоний, состоящих из > 50 ячеек.
сред Nikon

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
  2. Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи