Отказ от флуоресцентного фона в резонанс и СКР микроспектроскопия

Краткое содержание

Мы обсуждаем строительство и эксплуатация сложных нелинейных оптической системой, которая использует сверхбыстрый все-оптической коммутации, чтобы изолировать от комбинационного сигналов флуоресценции. С помощью этой системы мы можем успешно отдельных комбинационного и сигналов флуоресценции использования энергии импульсов и средней мощности, которые остаются биологически безопасна.

Аннотация

Спектроскопии комбинационного рассеяния света, часто страдают от сильного флуоресцентного фона, особенно для биологических образцов. Если образец возбуждается с поездом сверхбыстрых импульсов, система, которая может временно отдельных спектрально перекрывающихся сигналов на пикосекундных сроки может изолировать оперативно прибывать комбинационного рассеянного света с конца прибывает света флуоресценции. Здесь мы обсуждаем строительство и эксплуатация сложных нелинейных оптической системой, которая использует все-оптической коммутации в виде маломощных Керра ворот, чтобы изолировать КР и флуоресценции. Один 808 нм лазер с 2,4 Вт средней мощности и 80 МГц частотой повторения разбита на разделы, с примерно 200 мВт 808 нм огонь должен быть преобразован в <5 мВт 404 нм свет направляется образец для возбуждения комбинационного рассеяния. Остальные необращенных 808 нм свет затем отправляется в нелинейной среде, где она действует как насос для всех-оптический затвор. Затвор открывается и закрывается в 800 фс с максимальной эффективностью около 5%. С помощью этой системы мы можем успешно отдельных КР и флуоресценции сигналов на 80 МГц частотой повторения импульсов использования энергии и средней мощности, которые остаются биологически безопасна. Потому что система не имеет свободные мощности по оптической мощности, мы подробно несколько соображений дизайна и выравнивание, которые помогают в увеличении пропускной способности системы. Мы также обсуждаем наш протокол для получения пространственной и временной перекрытие сигнала и накачки пучками в керровской среде, а также подробный протокол для спектрального приобретения. Наконец, мы приводим некоторые результаты представителя спектров комбинационного рассеяния, полученные в присутствии сильных флуоресценции с помощью нашего времени литниковой системы.

Протокол

1. Некоторые забота должна быть взята в подготовке и размещении комбинационного образца в рамках этой системы.

1. Потому что система обычно использует очень высокое численное целей диафрагмы с очень коротким рабочим расстоянием, образцы находятся на покровное. Биологические образцы, как правило, размещены на № 1 толщина покровного установлен в камере Attofluor клетки (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния).
2. Жидкие образцы, особенно токсичен для человека, помещаются в небольшой стеклянный флакон с покровным цементируют к открытию при помощи силиконовой смолы. Затем бутылку перевернутой для измерения.
3. Потому что наши системы зависит от точного времени накачки и сигнала импульсы, мы вынуждены отказаться от использования обычных регулировка фокуса нашего микроскопа, который переводит цель вверх и вниз. Это добавляет и вычитает оптический путь из нашей системы. Вместо этого, мы размещаем наших образцов на второй стадии установлены на вершине столике микроскопа, который имеет свой собственный независимый контроль фокуса.

2. Для того, чтобы занять время закрытого спектров комбинационного рассеяния, возбуждения пучка должна быть должным образом подготовлены.

1. Начнем с света, выходящего из 2,4 Вт импульсный перестраиваемый титан-Sapph лазера (Chameleon, Когерентные Systems, Санта-Клара, Калифорния). Каждый импульс в 80 МГц поезд импульса 30 нДж энергии, имеет временную ширину 140 фс и имеет спектр с центром в точке 808 нм со спектральным пропускной способностью ~ 6 нм.
2. Чтобы предотвратить резервного отражения от повторного ввода лазерного резонатора, свет проходит через изолятор Фарадея. Полуволновой пластинки поставил перед изолятор Фарадея позволяет осуществлять непрерывную настройку суммарной мощностью отправлен в системе.
3. Потому что 6 нм является слишком широким пропускной способности решить большинство комбинационном режимах, луч направляется через очень узкие (0,8 нм FWHM, Andover корпорации, Салем, Нью-Хэмпшир) полосовой фильтр с центром в точке 808 нм.
4. Свет затем фокусируется ахроматический дублет (F = 100 мм) на 5 мм β-Борат Бария (ВВО) кристалла (CASIX, Фучжоу, провинция Фуцзянь, Китай) в два раза сократить длину волны от 808 нм до 404 нм. ВВО кристалла помещается в гору с наконечником и наклон контроля, а также установленные на этапе трансляции. Для обеспечения максимальной эффективности от длины волны преобразования, кристалл должен быть помещен точно симметрично относительно фокуса дублет, и с его осью кристалла выравнивается по поляризации входящего луча.
5. Потому что эффективность преобразования длины волны зависит от поляризации, контроль за количеством света направляется образец может быть получен путем размещения второй половине пластинка после изолятора Фарадея. При вращении этого Фазовые пластины, интенсивность света направляется образец можно регулировать независимо от интенсивности отправлен в пучка накачки (будет сказано ниже).
6. Длины волны света преобразуется recollimated вторым ахроматический дублет (F = 500 мм) выбрана так, что выхода луча достаточно большой, чтобы заполнить назад апертура объектива микроскопа, а также направлен в инвертированного микроскопа (IX-71, Olympus, Центр долине, штат Пенсильвания) с помощью двух зеркал, руля.
7. Объектива микроскопа, будучи оптический элемент размещается в самых монолитных компонент системы, определяет оптической оси. Для выравнивания возбуждения луч к этой оси, зеркало находится в плоскости образца микроскопа. Два зеркала, рулевое управление, затем итеративно настроены при соблюдении резервного отраженного лазерного луча на ПЗС-камеру эпохи (μEye, IDS, Obersulm, Германия), подключенных к порту визуализации микроскопа. Если предположить, что изображение на камеру сосредоточена на микроскопа поля-обзора, луч на оси, когда фокусного пятна сосредоточена на чипе микроскоп и перевод цель вдоль оси не изменится центральная точка из расфокусированным лучом.
8. Когда образец помещается в плоскости образца и облучении лазерным светом комбинационное рассеяние происходит. Дихроичных фильтре, расположенном ниже объектива микроскопа отделяет длины волны смещенной комбинационного рассеянного света (и флуоресценции) от возбуждения луч, направляя комбинационного рассеянного света в сторону порта микроскопом. Микроскоп был изменен, чтобы удалить любые линзы в течение этого пути, так, чтобы световой сигнал выходит из микроскоп коллимированного.
9. Поскольку сигнал пучок, выходящий из микроскоп больше ясно отверстие Глана-Томпсона поляризаторы, 0.47x телескоп построен из двух ахроматических дублетов (f1 = 75 мм, 2 = 35 мм) используется для сжатия пучка.
10. Световой сигнал, затем поляризованный Глана-Томпсона поляризатор ориентирован на 0 ° по отношению к вертикали в лабораторной системе, и направлен на дихроичных зеркал, где она рекомбинированное с пучка накачки.

3. Для того, чтобы оптический затвор, чтобы работать с максимальной эффективностью, необходимо соблюдать осторожность при подготовке пучка накачки (Kerr луч), а также.

Импульса накачки первый усугубляется 0.35x с телескопом построено с двумя ахроматических дублетов (f1 = 35 мм, 2 = 100 мм), чтобы соответствовать конечный размер луча.
1. Пучка накачки затем отправляется в линии задержки состоит из прямой призмы угол размещены на линейной стадии перевод, который может быть настроен для обеспечения временным перекрытием накачки и сигнала импульсов (настройки, которые будут обсуждаться ниже).
2. После линии задержки, луч направляется через полуволновой пластинки и поляризатора ориентированы на 45 ° по отношению к вертикали в лабораторной системе. Это гарантирует надлежащее состояние поляризации пучка накачки, когда он достигает нелинейной среде.
3. Свет затем отражается от двух зеркал руля, один с пьезо-электрическим управлением, которые используются для точной регулировки положения пучка накачки, что он перекрывает с пространственно сигнального луча. Перекрытие получается, наблюдая насоса и сигнального пучков в двух местах, один близко и далеко не один дихроичных зеркал, где лучи вместе взятые. Используя первое зеркало рулевого перекрываться два пучка в ближней точке, и зеркало пьезо перекрывать пучки на дальней точке, пучка накачки могут быть сделаны точно коллинеарны сигнального луча.
4. С двумя пучками вместе взятые, ворота Керр и системы сбора настроены на максимально собраны время закрытого сигнала.

4. С двумя пучками вместе взятые, ворота Керр и системы сбора настроены на максимально собраны время закрытого сигнала.

1. Насос и сигнального пучков сначала проходили через дихроичных фильтра, который имеет наружный диаметр 6 при 404 нм для предотвращения остаточного света возбуждения от захватывающих комбинационного рассеяния света в нелинейной среде.
2. Накачки и сигнала луча, то оба фокусировались ахроматический дублет (F = 35 мм) в 1 см, длина пути кварцевые кюветы нелинейного материала. Любые нелинейные материал, имеющий достаточно высокую нелинейного показателя (выше, чем CS _2), и соответствующим образом короткий временной отклик (<2 пс), могут быть использованы здесь. Для этих экспериментов мы используем сероуглерод, CS _2, который имеет нелинейный показатель N ₂ = 3,1 · 10 ^-18 м ² / Вт Свет затем recollimated на второй дублет с фокусным расстоянием идентичен первому.
3. Лучи затем пропускается через и Глана-Томпсона анализатор на вращающемся гору, а затем через набор поглощения и интерференционных фильтров, которые вместе взятые ОП 10 на 808 нм.
4. Наконец, световой сигнал фокусируется ахроматический дублет (F = 35 мм) в 50 мкм многомодового оптического волокна, где слой монтируется в стадии перевода, который позволяет по х, у, z. Волокно то связан с коммерческой спектрограф изображений с прикрепленными CCD камера (SP2300i и Pixis 100B, соответственно, оба производства Princeton Instruments, Трентон, штат Нью-Джерси).
5. Для выравнивания системы сбора максимально собраны сигнала, анализатор установлен на 0 °, а тестовый образец толуола находится в плоскости образца. Регулируя х, у и z. управления волоконно горе, собранной комбинационного сигнала оптимизированы.
6. Для обеспечения надлежащего пространственного и временного перекрытия насоса и сигнального пучков, зеркало находится в плоскости образца микроскопа. 404 нм фильтр удаляется из системы. С анализатор поворачивается на 90 ° retroreflected луч 404 нм направляется в спектрограф с интенсивностью регулируется таким образом, что она не насыщает камеры. С пучка накачки прочь, анализатор поворачивается, чтобы минимизировать передаваемый сигнал 404 нм. С пучка накачки снова включается, задержка стадии медленно настроены до передачи света 404 нм начинает возрастать. Тогда, по итеративно настройка задержки этапе, пьезоэлектрические зеркало, и х, у и z. контроль волокна, один максимальный сигнал.
7. Поскольку ретро-отраженный луч 404 нм и комбинационного рассеянного света может занять немного разными путями через систему, окончательные корректировки производятся путем размещения сильный комбинационного рассеивателя (например, толуол) на сцене образца и слегка настройки выравнивания путем изменения Задержка этапе piezeo-электрические зеркала, а х, у и z. управления волоконно оптимизировать комбинационного сигнала.

5. Сборник один раз закрытого спектр комбинационного рассеяния требует приобретения нескольких спектров для коррекции артефактов системы.

1. С анализатор установлен на 0 °, возбуждение пучка на и пучка накачки прочь, "ungated" спектр снят, представляющий спектр, который будет приобретаться без использования временных литниковой системы.
2. С анализатор установлен в 90 °, возбуждение пучка и пучка накачки по-прежнему выключен, фон спектр снят, представляющий количество постороннего света утечки через поляризаторы и других элементов в системе.
3. С анализатором оставшихся под углом 90 °и все балки на, "закрытых" спектр снят, представляющих комбинационного рассеянного света пропускается через скрещенные поляризаторы наличием пучка накачки.
4. Наконец, анализатор еще на 90 °, луч от возбуждения и пучка накачки на, второе спектр фона берется, представляющие вклад в "закрытых" Спектр остаточных количеств 808 нм свет, попадающий в спектрограф.
5. Кроме того, спектр снят со всеми лазеров прочь, характеризующих базовый "темных" уровень сигнала камеры и электроники.
6. Поскольку спектры часто требуют длительной раз интеграцию, крайне важно, чтобы разорвать этот время интеграции на несколько частей (кадров) для обеспечения надлежащего коррекции космических лучей - частая проблема при получении данных через пролеты несколько минут.

6. Как только приобрел несколько этапов обработки полезны для улучшения качества и внешнего вида данных.

1. Во-первых, все спектры темно исправлены путем вычитания от "темного" спектра.
2. Для исправления для космических лучей, несколько кадров, составляющие один приобретения сравниваются друг с другом на пиксель на уровне точек. Для любого пикселя любой кадр, который выходит за пределы 2 Средний отклонений от медианного значения для этого пиксела во всех кадрах, значение этого пикселя заменяется среднее значение для всех кадров.
3. Космических лучей исправлены кадры затем усредняются и сглажены Савицкого-Голея фильтра ^1.
4. Для извлечения "истинного" закрытых спектра, мы вычитаем "возбуждение только" и "насос-только" спектров из измеренной закрытого спектра.
5. Наконец, закрытого типа, и ungated спектры затем фоне исправлены путем вычитания ^5-го порядка полинома, определяется с использованием метода Либер и Махадеван-Янсен ^2.

7. Представитель Результаты:

Рисунок 1. Принципиальная схема системы стробирования Керр. Путь луча накачки отображается красным цветом, в то время ГВГ путь показаны синим цветом. Путь, где КР и флуоресценции перекрываются отображается зеленым цветом, а путь, по которому флуоресценции была временно отфильтрованы показан желтым цветом. Сокращения следующим образом: БНФ, полосовой фильтр, ПЗС, прибор с зарядовой связью; DCM, дихроичных зеркал; FI, изолятор Фарадея; λ / 2, плиты полуволны; ФНЧ, длинный фильтр; NLM, нелинейной среде; P, поляризатор ; ГВГ, второй гармоники кристалл поколения.

Рисунок 2 Top:. Сырье спектры кумарин, растворенных в погружении на нефть. Красная кривая показывает спектр принимать с открытыми воротами (анализатор установлено на максимальную передачу). Черная кривая показывает спектр принимать с анализатором соответствие минимальной передачи и пучка накачки применяется (закрытого спектра). Синяя кривая показывает spectum принимать с анализатором соответствие минимальной передачи и не пучка накачки применяется (затвор удерживается в закрытом положении). Зеленая кривая показывает спектр приняты только с пучка накачки применяется. Пунктирные линии показывают, пурпурный области спектра показаны на панели ниже. Все спектры были сглажены с 11 точкой, 3-го порядка Савицкого-Голея фильтр. Внизу: Спектры кумарин, растворенных в масле после погружения флуоресценции вычитание фона. Красная кривая спектра с открытыми воротами, а синяя кривая это закрытый спектра. Закрытого спектр ясно показывает, запутанные высокого волнового пик, характерный для масел.

Обсуждение

Области биомедицинской спектроскопии комбинационного рассеяния наблюдается возрастающий интерес в течение последних нескольких лет в результате его показали потенциал для решения ряда сложных проблем в биологической диагностики. Например, спектры комбинационного рассеяния было показано, что диагностическое значение при раке обнаружения ^{3, 4, 5, 6.} Спектроскопии комбинационного рассеяния света была также использована в бактериальных количественного ^{7, 8} и бактериальных ответ наркотиков ^9....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Имя	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Линзы	ThorLabs	Различный	Все линзы покрыты иметь максимальные потери передачи по 1%
Перестраиваемые Ti: Sapph лазерной	Когерентный	Хамелеон	30 нДж, 200 фс, 80 МГц
40X цель погружения нефти	Олимп	UApo/340	NA = 1,35
Инвертационный микроскоп	Олимп	IX-71	Изменения, чтобы удалить все линзы в сторону порта
Половина пластинки	Thorlabs	AHWP05M-600
Глана-Томпсона поляризатор	Thorlabs	GTH10M	~ 10% потери при передаче
Спектрометр	П. И. Актон	SP2300i
ПЗС	П. И. Актон	Pixis 100B
Mathmatical программного обеспечения	MathWorks	MATLAB	версии 2008a
Изолятор Фарадея	EOT	BB8-5I
Пьезоэлектрические зеркало	Ньюпорт	AG-M100
BBO кристалл	CASIX	обычай	Толщиной 1 мм
Полосовой фильтр 1	Андовер	008FC14	808 ± 0,4 нм
Дихроичных зеркал	Semrock	FF662-FDI01	края полосы на 662 нм
Длинный фильтр	Semrock	BLP01-405R	края полосы на 417 нм
Полосовой фильтр 2	Semrock	FF02-447/60	417-447 нм
CS 2	Sigma-Aldrich	335266	99% чистоты
Кумарин 30	Sigma-Aldrich	546127	99% чистоты
Погружение нефти	Cargille	16242	Тип DF