Карт и применение Enhancer-ловушки Выражение Flippase в личинок и взрослых Drosophila ЦНС

Краткое содержание

Мы описываем Flippase вызванных пересеченную Gal80/Gal4 репрессий (FINGR) метод, позволяющий тканеспецифические ФЛП, чтобы определить Gal80 моделей выражения. Везде, где Gal4 и ФЛП перекрываются, Gal4 выражение включена (Gal80 обалдела) или выключает (Gal80 перевернуто в). Метод FINGR является универсальным для клонального анализа и нейронных отображение контура.

Аннотация

Gal4 / UES бинарный метод является мощным для генной манипуляции и нейронных схем у дрозофилы. Для большинства нейробиологических исследований, однако, Gal4 выражение редко тканеспецифические достаточно, чтобы обеспечить точное соотношение цепь с поведенческими показаний. Чтобы преодолеть это главное препятствие, недавно мы разработали FINGR методом достижения более ограничительный Gal4 выражение в ткани интересов. Метод FINGR состоит из трех компонентов: 1) традиционная система Gal4/UAS, 2) набор ФЛП / FRT-опосредованной Gal80 преобразования инструменты, и 3) усилитель-ловушки ФЛП (ET-ФЛП). Gal4 используется для определения первичной нервной системы интересов. Кожура Gal4 с UAS-эффектора, таких как UAS-MJD78Q или UAS-Ши ^тс, регулирует активность нейронов, которые, в свою очередь проявляются изменения в поведении летать. С дополнительной UAS-репортер, таких как UAS-GFP, нейронная цепь, участвующих в определенное поведение может быть одновременно отображается для морфологического анализа. Для Gal4 линий с широкой выражения, Gal4 выражения может быть ограничена с помощью двух дополнительных Gal80-превращающего инструменты: ванны ^P> Gal80> ('откидывающейся') и ванной ^P> остановка> Gal80 («флип в '). Наконец, следователи могут обратиться Gal80 или выключить, соответственно, с помощью тканеспецифические ET-ФЛП. В флип-в режиме Gal80 будет подавлять Gal4 выражение там, где Gal4 и ET-ФЛП пересекаются. В откидной режиме Gal80 избавит Gal4 репрессий в клетках, в которых Gal4 и ФЛП перекрываются. Оба подхода позволяют ограничение числа клеток в Gal4 определенные схемы, но в обратную картину. Метод FINGR совместим с обширной коллекцией Gal4 линий в лету сообщества и в высшей степени универсальным для традиционных клонального анализа и нейронных отображение контура. В этом протоколе, мы демонстрируем отображение модели ФЛП выражение в некоторых ET-FLPx2 линий и эффективности FINGR метод в фоторецепторных клеток. Принцип FINGR метод должен быть применим и к другим генетическим организмов модель, в которой Gal4/UAS, Gal80 и ФЛП / FRT используются.

Протокол

1. Дрозофилы штаммов

1. Gal4 водителя:
   GMR-Gal4, которая выражает Gal4 в фоторецепторных клеток.
2. UAS линий
   UAS-MJD78Q (или UAS-polyQ), что приводит к нейронной дегенерации Gal4-экспрессирующих клеток.
   UAS-GFP, который выражает GFP в Gal4-экспрессирующих клеток.
3. ФЛП линий
   еу-ФЛП, которая выражает ФЛП в фоторецепторы и в подмножествах области мозга.
   ET-FLPx2 линий, усилитель-ловушки строки, содержащие две копии ФЛП (ФЛП-IRES-ФЛП). Мы сгенерировали ~ 1000 ET-ФЛП линий (Бома и соавт., 2010), чье выражение модели еще не охарактеризованы. Здесь мы описываем характеристики экспрессии избранных ET-FLPx2 в личиночной и взрослой летать центральной нервной системы (ЦНС).
4. ФЛП репортер
   YW, актин ^P> CD2> Gal4; UAS-GFP (Pignoni & Zipursky, 1997), который сообщает экспрессии ЕТ-FLPx2 через актин ^P> Gal4; UAS-GFP на ФЛП-опосредованной рекомбинационной иссечение> CD2.
5. Два дополнительных Gal80-превращающего инструменты
   Ванной ^P> Gal80> (Gordon & Scott, 2009), откидной конструкции, которая выражает конститутивно Gal80 во всех тканях обусловлен сильный промотор тубулина. По ФЛП-опосредованной рекомбинации,> Gal80 переворачивается, и Gal80 выражение прекращено только в ET-FLPx2 экспрессирующих тканей.
   Ванной ^P> остановить> Gal80 (Бем и соавт., 2010), флип-в конструкцию, которая не выражает Gal80 в нормальных условиях. Gal80 выражение включена по тубулина промоутер только в ET-FLPx2 экспрессирующих тканей, в которых ФЛП поворачивается> остановиться и сальто в Gal80.
6. Мухи для проверки ФЛП деятельность в сложный глаз
   GMR-Gal4, UAS-polyQ; ванны ^P> остановка> Gal80 (Бома и др., 2010.), Которая имеет вырожденных и пигментации глаз. В ФЛП экспрессией клетки фоторецепторов, polyQ выражение выключен следующие Gal80 флип-ин.
   GMR-Gal4, UAS-polyQ; (. Бома и др., 2010) ванны ^P> Gal80>, которая имеет нормальный глаз. В ФЛП экспрессией клетки фоторецепторов, polyQ выражение включено следующее Gal80 флип-аут.

2. Реагенты

Фосфат-солевом буфере (PBS, 1X), рН 7,4.
4% параформальдегида (PFA), разводят в PBS с 16% PFA, Е. М. сорт (Cat # 15710, электронная микроскопия наук, Хатфилд, PA)
PBT, 1XPBS, содержащего 0,1% Triton-X 100 (Sigma)
Анти-Elav (МАБ, 9F8A9; развитием исследований Гибридома Банк, Университет Айовы), пятна всех нейронов у дрозофилы.
Анти-Репо (МКА 8D12; развитием исследований Гибридома Банк, Университет Айовы) пятна глиальных клеток у дрозофилы.
Alexa 594 куриных против мыши вторичные антитела (Invitrogen)

3. Сопоставление выражения структуры усилитель-ловушки линии FLPx2 (* критических шагов)

1. Сбор дев самок из уш, актин ^P> CD2> Gal4; UAS-GFP линии и крест, чтобы мужчины отдельных ET-FLPx2 линий. Бывший служит GFP репортер ткани выражение ET-ФЛП.
2. * Рассеките блуждающих _3-го возраста F1 личинки, сохраняют ЦНС (например, головного мозга и брюшной нервной цепочки, VNC) и стенки тела, исправить в течение 1 часа в 4% PFA на лед, мыть 3X ледяным PBS следуют 3X промывок PBT.
   Рассечение
   1. Удалить блуждающих ^3-го возраста F1 личинок и поместить их в чистое блюдо Sylgard (35 мм х 10 мм чашки Петри заполнены 2 грамма Sylgard - смешанные по производству инструкции).
      1. Удалить остатки пищи с кистью
   2. Заполните блюдо с ледяной 1XPBS и поставьте на лед, чтобы обезболить личинки
   3. Держите рот крючки личинка с парой щипцов и захватить кутикулы возле расширение передних дыхало с другой парой щипцов и очистить кутикулу к заднему концу. ЦНС будет прикреплен к устью крючки вместе с слюнные железы, кишечника, и имагинальных дисков.
   4. Удаление избыточной ткани и имагинальные диски окружающих ЦНС.
   5. Передача ЦНС в PBS-3 хорошо заполнены блюдо Pyrex.
      1. Силиконизированный P200 пипетки можно использовать, чтобы избежать высыхания тканей.
   6. Fix в течение 1 часа в 200 мкл 4% PFA на льду.
      1. Убедитесь, что ЦНС является полностью погружен в PFA.
         1. Если ЦНС плавает, это обычно означает, что ЦНС не надлежащим образом очищены от окружающих тканей.
   7. Вымойте 3X ледяным PBS следуют 3X промывок PBT.
3. * Рассеките ЦНС взрослых мух F1.
   1. Обезболить мух CO ₂ или место мух содержится внутри пустой флакон на льду в течение 10 минут.
   2. Место взрослых мух на 95% этанола заполненный стеклянной посуде на льду в течение 30 сек.
   3. Передача взрослых мух в 1XPBS заполнены стеклянной посуде на льду.
      1. Вымойте 3X ледяной 1X PBS для удаления остатков этанола
   4. Место летать в 35 Sylgaй блюдо заполнено ледяным 1X PBS
   5. Место вентральной стороной вверх и вставить небольшой перо насекомых (minutiens контактов 0,1 мм) в середине живота.
      1. Используя пару щипцов держать базу ноги и снять ноги с другой парой щипцов.
   6. Удалите головы кутикулы
      1. Хотя захват хоботок с одной парой щипцов, место другого под глазом и кожуры кутикулы на спинной средней линии лететь головы.
      2. Возьмите другой глаз и устранить оставшиеся кутикулы с другой стороны.
      3. Использование резкого щипцы и / или заостренным вольфрамовой иглой, удалить трахеи ткани, окружающие головной мозг
         1. Неправильная чистка трахеи приведет к сильным авто-флуоресценция, препятствующих GFP выражение, и позволяют мозгу во время крепления поплавка
   7. VNC Dissection
      1. Удаление грудной кутикулы
         1. Начиная с задним концом грудной клетки, за два щипцы с каждой стороны ^3-го preepisternum (например, захват базы задних ног).
         2. Аккуратно отделить кутикулу от вентральной линии средней линии, повторите это, пока не дойдете до основания шеи.
         3. Аккуратно распространение две половины грудной кутикулы подвергая VNC
      2. Следующая удалить из брюшной полости грудной клетки. При использовании пара щипцов провести грудной клетки на вторую базу ногу, использовать другую пару щипцов, чтобы захватить животе возле первого стерпит брюшка и тянуть живот выключен.
      3. Для удаления VNC от окружающих грудной ткани. Держите плечевой области с парой щипцов и с другой парой щипцов нежный оторвать большинство грудной туши.
      4. В этот момент не должно быть кольцо соединительной ткани, окружающей соединительной шейки (шея). Использование двух щипцов разрыв кольца друг от друга.
      5. Удалите излишки грудной ткани, окружающие VNC
   8. Передача головного мозга и VNC для 9-а блюдо Pyrex содержащие 1X PBS на льду
      1. Силиконизированный P200 пипетки можно использовать, чтобы избежать высыхания тканей
4. * Исправлена ​​ошибка взрослых ЦНС в течение 1 часа в 4% PFA на льду и мыть 3X ледяным PBS и 3X с PBT.
5. Инкубируйте взрослых подготовки ЦНС или личиночной ЦНС и стенки тела при температуре 4 ° С в течение ночи с антителами либо нейронов (анти-Elav, 1:10) или глии (anti-Repo. 1:10). Вымойте подготовки 5X с PBT.
6. Инкубируйте со взрослыми или личиночной препарат с Alexa 594 куриных против мыши вторичные антитела (1:100) при комнатной температуре в течение 2 часов, и вымыть препарат с PBS.
7. Горы личиночной или взрослой ЦНС на слайде. Чтобы сохранить естественную форму ЦНС, использование О-формы пластиковым кольцом (Clear Этикетка Усиление, Avery Dennison, офиса, Бреа, Калифорния) на слайде, как мини-моста приостановить покровным стеклом.
8. Изучить подготовки к GFP и Elav (или репо) экспрессии под флуоресцентным микроскопом.

4. Применение двух дополнительных Gal80-превращающего инструментов репрессий Gal4 в фоторецепторы

1. Подавать Gal80 из ванны через ^P> Gal80> (рис. 5А).
   1. Сбор мужчин от GMR-Gal4, UAS-polyQ; ванны ^P> Gal80> линии. Обратите внимание, что сложные глаза нормальны в этих мух.
   2. Мате с еу-ФЛП девственниц.
   3. Сбор F1 мух и изучить глаз фенотип.
2. Подавать Gal80 в ванну через ^P> остановка> Gal80 (рис. 5B).
   1. Сбор GMR-Gal4, UAS-polyQ; ванны ^P> остановка> Gal80 самцов мух и изучить глаз фенотип. Обратите внимание, вырожденных и пигментации глаз в этих мух по сравнению с дикими штаммами типа (Canton-S)
   2. Мате с еу-ФЛП дев;
   3. Сбор F1 мух и изучить глаз фенотип.
3. Выберите ET-FLPx2 линии с выражением в фоторецепторных клеток

Шаги 4.1 и 4.2 может быть повторен с использованием ET-FLPx2 линии, которые выражают ФЛП в подмножество фоторецепторных клеток. Кроме того, ни GMR-Gal4, UAS-polyQ; ванны ^P> остановка> Gal80 мухи или GMR-Gal4, UAS-polyQ; ванны ^P> Gal80> мухи можно пересечь отдельным ET-FLPx2 линий на экран строки, которые выражают ФЛП в клетки фоторецепторов. Ценные ET-FLPx2 линиями являются те, которые только выразить ФЛП в подмножество или отдельные клетки фоторецепторов (рис. 6).

5. Представитель результаты

Экспрессии конкретного ET-FLPx2 линия может быть легко изучены и описаны в F1 личинок или взрослых мух, производные от скрещивания уш, актин ^P> CD2> Gal4; UAS-GFP девы и ET-FLPx2 мужчин (рис. 1) . Обычно от трех до пяти повторов F1 животных расчленены и проверить, чтобы определить воспроизводимости картины ФЛП выражение (Бома и соавт., 2010). (рис. 3 и 4).

Результаты, показанные на рисунке 7 иллюстрируют эффективность Gal80 флип-ин и флип-систем выдвижения в пересеченную репрессии Gal4 следующие ФЛП-опосредованной рекомбинации. Ванной ^P> остановить> Gal80 построить не оказывает какого-либо вытекающих выражение Gal80 (на основе единых дегенерации и депигментация фоторецепторы), и все же она на 100% эффективность в листать Gal80 в систему с помощью eyFLP подавить GMR- Gal4 и восстановления глаз в нормальный внешний вид (рис. 7а). Напротив, ванна ^P> Gal80> полностью подавляет GMR-Gal4 до введения eyFLP. После Gal80 флип-выход, GMR-Gal4 диски UAS-polyQ выражении, что привело к деградации и пигментации глаз (рис. 7б). В этом примере мы использовали пан-photorecetor ФЛП на карту "схем" фоторецепторов, но не рассматривал поведенческие последствия. Используя аналогичные подходы с поведенчески соответствующих Gal4 линий, мы отображается часть CCAP-Gal4 цепь регулирующего крыло расширение у взрослых мух (Бома и соавт., 2010). Мы считаем, что метод FINGR будет ценно в пособничестве наше понимание нейронных основе поведения.

Рисунок 1. . Рассматривая выражение структуры ET-FLPx2 линия картины ФЛП выражение (синий овал) от ET-FLPx2 линия может быть определена путем скрещивания ET-FLPx2 мужчин (вверху слева) с актином ^P> CD2> Gal4; UAS- GFP девственница (вверху справа). Повсеместный актина ^P> Gal4 выражение в родительских женщин мешает вставки FRT (серые треугольники) окружении последовательность CD2. В F1 потомство, ФЛП будет акцизного последовательность CD2, что позволяет актина ^P> Gal4 ездить UAS-GFP выражения.

Рисунок 2. Выражение структуры ET-FLPx2 линии в личиночной и взрослой центральной нервной системы. Эти снимки изображают ЦНС (головной и брюшной нервный тяж, VNC) расчлененный от потомства от спаривания уш, актин ^P> CD2> Gal4; UAS-GFP родителей ET-FLPx2 173a линии. По рекомбинирующих из> CD2> кассеты, ФЛП активируется актином ^P> GAL4 выражение (последующее выражение UAS-GFP). Таким образом, картина GFP отчетов ФЛП-экспрессирующих клеток. Группа показывает личиночной выражению ФЛП в то время как панели В показаны взрослых выражению в соответствии 173a.

Рисунок 3. Характеристика типов клеток, которые выражают flippase в ET-FLPx2 Строка № 688A., Составного изображения фиксированной F1 ^3-го возраста личинки окрашивали анти-РЕПО с крестом между ET-FLPx2 линии № 688A и отчетности GFP Flippase линии. Б.Д., большим увеличением (Zeiss План-Apochromat 63x масло) зрения, взятых из заднем конце VNC от ^3-го возраста личинки.

Рисунок 4. Характеристика типов клеток в теле гриба ET-FLPx2 Строка № 150. Переменного тока, с большим увеличением изображения (63x нефти погружение) гриба тело от фиксированной F1 третьего возраста личинка окрашивали анти-РЕПО.

Рисунок 5. Иллюстрация Gal80 Flip-в и Flip-из стратегий. А. В откидной стратегии, тубулина промоутер управляемой Gal80 (ванна ^P> Gal80>) является конститутивно, в результате репрессий GMR-Gal4 и дикого типа глаз фенотип (красные глаза). Это подавление снимается введением ФЛП (фиолетовый), который будет флип Gal80 из (средний, красный) и позволяют GMR-Gal4 ездить UAS-polyQ выражения. Это приводит к дегенерации клетка фоторецептор (показано белыми точками в глаза). B. В обратную предыдущей стратегии, тубулина промоутер управляемой Gal80 выражения прерывается FRT (серый треугольник) окружении "стоп" кодон. При отсутствии Gal80, GMR-Gal4 связывается с UAS-polyQ вызывает дегенерацию нейронов в фоторецепторы (показано белыми точками в глаза). Путем скрещивания GMR-Gal4, UAS-polyQ; ванны ^P> остановка> GAL80 мужчин с девственных самок, которые выражают ФЛП в клетки фоторецепторов, ФЛП (фиолетовый) станет катализатором рекомбинации на FRT сайтов, вырезанием "стоп"-кодон (в центре, красный), что позволяет обеспечить Gal80 выражения и репрессии GMR-Gal4. Это оставляет за собой нейродегенеративные в фоторецепторных клеток (иллюстрируется отсутствием WХайт точек в глаза).

Рисунок 6. Применение метода в FINGR листать Gal80 с помощью ET-FLPx2 Строка № 688A F1 потомство от скрещивания между ET-FLPx2 линии № 688A девою GMR-Gal4, UAS-polyQ;. TubP> GAL80 мужчины. Отсутствие пигмента в середине глаз омматидии представляет ФЛП выражение в строку # 688A. В этой области Gal80 подавление GMR-Gal4 был освобожден позволяет Gal4 ездить UAS-polyQ.

Рисунок 7. Применение метода в FINGR листать Gal80 или уменьшение пересекаются Gal4 в фоторецепторы. А. ванной ^P> остановка> Gal80 флип-в системе ограничивает GAL4 выражение в FLP-зависимым образом. В GMR-Gal4, UAS-polyQ; ванны ^P> остановка> GAL80 мух, клетки фоторецепторов являются вырожденными и депигментированные (слева лету). После введения eyFLP, Gal80 выражается в фоторецепторных клеток, что приводит к полному подавлению GMR-Gal4, который в свою очередь отключает выражение polyQ и производит мухи с нормальными глазами (право летать). Б. ванной ^P> Gal80> флип -системе работает противоположным образом, как ванная ^P> остановка> Gal80 флип-в системе. Ванной ^P> Gal80> конститутивно подавляет GAL4 и подавляет экспрессию polyQ (слева летать, с нормальными глазами). После введения eyFLP, Gal80 переворачивается из клетки фоторецепторов, избавляя подавление GMR-Gal4 и включение выражения polyQ. Это приводит к мух с вырожденными и пигментации глаз (правый лету).

Обсуждение

Система Gal4/UAS широко и успешно используется Drosophilists для различных биологических исследований (Brand & Perrimon, 1993; Duffy, 2002). На сегодняшний день летают сообщество породило тысячи промоутер-приводом и усилителем-ловушки Gal4 линий. Одна из основных сильных метод FINGR является то, что он совместим с системой Gal4/UAS, что позволяет значительно расширить сила Gal4 у дрозофилы исследований.

Одним из важных применения метода FINGR является для тонкой настройки нейронных цепей, лежащие в основе поведения через Gal4/Gal80 пересечения. Такие действия могут включать, но не ограничиваясь этим, обучение и память, ухаживания, сон и суточный ритм. Метод FINGR также может быть использован для отображения критических нейронов, которые склонны к нейродегенерации в области моделирования человеческих нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз (ALS), и болезни Паркинсона. Кроме того, очаги нейронов или нейронных цепей решающее значение для посреднической кокаин, алкоголь, наркомания и другие вещества могут быть отображены использованием FINGR метод. Следует отметить, что условные Gal4s (Остервальдер и др., 2001;.. Римского и др., 2001) может быть использована с FINGR метод для того, чтобы получить временное управление нейронных цепей и поведения. Модификация Gal80-превращающего инструментов с помощью чувствительного к температуре Gal80 (Gal80 ^тс, McGuire и соавт., 2003) может привести к ванне ^P> остановка> Gal80 ^TS или ванной ^P> Gal80 ^ц>, дополнительно временной гибкости в цепь манипуляций. Кроме нервной системы, метод FINGR в равной степени применима к ограничению Gal4 выражение в подмножества клеток будь то крыло или ногу.

ET-FLPx2 линии будут ценным ресурсом для всех биологов дрозофилы заинтересованы в FRT / FLP основе клонального анализа (Xu & Рубин, 1993), в том числе MARCM (Lee & Ло, 1999). Кроме того, ожидается, что некоторые ET-FLPx2 линии могут заменить heatshock-ФЛП для производства воспроизводимых клонов и для повторных морфологических и поведенческих исследований. Как усилитель-ловушки Gal4 линий, наиболее ET-FLPx2 линии вряд ли могут быть выражены в частности, в клетках своих интересов. Большинство линий будет выражать ФЛП в клетках интерес и в других клеток или тканей, а также. Тем не менее, отсутствие "тканевой специфичности» как Gal4 и ET-FLPx2 не будет серьезной проблемой для FINGR метод, пока их области перекрытия желательно для конкретного эксперимента. FINGR призвана превратить два "широким" систем в изысканной один.

Методами показано на этих протоколов, а стандартные и должны быть воспроизводимыми. Основные предостерегающие шаги, которые требуют внимания своей являются отбор и использование фиксатора. Фиксаторы, кроме PFA следует избегать, потому что они утолят GFP сигнала. Мы также отметили, что рассечение блюдо не должно использоваться для фиксации с PFA, чтобы избежать возможности того, что ФЛП выражение не будет надежно сообщает GFP.