Методическая статья

Высокая чувствительность 5-hydroxymethylcytosine Обнаружение в Balb / C ткани мозга

17.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2661

⸱

1 февраля 2011 г.

 , 
1Applications and Product Development, New England Biolabs

В этой статье

Краткое содержание

EpiMark 5-HMC и 5-тС Анализ Kit может быть использован для анализа и количественного 5-метилцитозин и 5-hydroxymethylcytosine в специально cific локуса. Комплект отличается 5-тС из 5-HMC добавлением глюкозы в гидроксильные группы 5-HMC через ферментативной реакции использованием β-glucosyltransferase (Т4-BGT). Когда 5-HMC происходит в контексте КСДУ, эта модификация превращает расщепляемого сайт MspI к не-расщепляемого сайта.

Аннотация

Гидроксиметилирование ДНК является известной с давних пор модификацией ДНК, однако в последнее время оно стало объектом пристального внимания в эпигенетических исследованиях. ДНК млекопитающих подвергается ферментативной модификации по 5му положению углерода остатков цитозина (C) с образованием 5-mC, преимущественно в контексте CpG-динуклеотидов. 5-mC может подвергаться ферментативному окислению до 5-hmC под действием ферментов семейства Tet, которые, как полагают, участвуют в процессах развития и патогенезе заболеваний. В настоящее время биологическая роль 5-hmC изучена не полностью, однако она вызывает значительный интерес благодаря своему потенциалу в качестве биомаркера. Это обусловлено рядом новаторских исследований, в которых 5-гидроксиметилцитозин был обнаружен в эмбриональных стволовых (ЭС) и нейрональных клетках мыши.

Методы исследований, включая методы бисульфитного секвенирования, не позволяют легко дифференцировать 5-mC и 5-hmC. Существует несколько протоколов, позволяющих измерить общее количество 5-гидроксиметилцитозина в геноме, включая жидкостную хроматографию в сочетании с масс-спектрометрическим анализом или тонкослойную хроматографию одиночных нуклеозидов, полученных путем расщепления геномной ДНК. Также существуют антитела к 5-гидроксиметилцитозину, которые можно использовать для дот-блот анализа, иммунофлуоресценции или осаждения гидроксиметилированной ДНК, однако эти антитела не обладают однонуклеотидным разрешением. Кроме того, разрешение зависит от размера иммунопреципитированной ДНК, а для экспериментов с микрочипами — от дизайна зондов. Поскольку точно неизвестно, где именно в геноме локализуется 5-гидроксиметилцитозин и какова его роль в эпигенетической регуляции, необходимы новые методы, способные идентифицировать локус-специфическое гидроксиметилирование. Набор для анализа EpiMark 5-hmC и 5-mC предоставляет решение для разграничения этих двух модификаций в конкретных локусах.

Набор для анализа EpiMark 5-hmC и 5-mC представляет собой простой и надежный метод идентификации и количественного определения 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина в определенном локусе ДНК. Этот ферментативный подход основан на различной чувствительности изошизомеров MspI и HpaII к метилированию и реализуется в рамках простого трехэтапного протокола.

Целевую геномную ДНК обрабатывают T4-BGT, что приводит к присоединению глюкозного остатка к 5-гидроксиметилцитозину. Эта реакция не зависит от последовательности, поэтому весь 5-hmC будет глюкозилирован; немодифицированная ДНК или ДНК, содержащая 5-mC, не подвергнется воздействию.

За глюкозилированием следует переваривание рестрикционными эндонуклеазами. MspI и HpaII распознают одну и ту же последовательность (CCGG), но чувствительны к разным состояниям метилирования. HpaII расщепляет только полностью немодифицированный сайт: любая модификация (5-mC, 5-hmC или 5-ghmC) любого из цитозинов блокирует расщепление. MspI распознает и расщепляет 5-mC и 5-hmC, но не 5-ghmC.

Третья часть протокола заключается в анализе локуса с помощью ПЦР. Можно использовать даже 20 ng исходной ДНК. Выполняется амплификация экспериментальной (глюкозилированной и перевариваемой) и контрольной (имитирующей глюкозилирование и переваривание) целевой ДНК с помощью праймеров, фланкирующих интересующий сайт CCGG (100-200 bp). Если сайт CpG содержит 5-гидроксиметилцитозин, то после глюкозилирования и переваривания обнаруживается полоса, которая отсутствует в контрольной реакции без глюкозилирования. ПЦР в реальном времени позволит примерно определить количество гидроксиметилцитозина в данном конкретном сайте.

В данном эксперименте мы определим количество 5-гидроксиметилцитозина в образце мозга мыши Babl/C с помощью ПЦР с определением конечной точки.

Протокол

1. Glucosylation ДНК и контроля реакции

  1. В 1,5 мл реакционной трубы на лед, перемешать 5-10 мкг геномной ДНК (для конечной концентрации 30 мкг / мл), 12,4 мкл UDP-глюкозы (для конечной концентрации 80 мкмоль), 31 мкл NEBuffer 4 и до 310 мкл нуклеазы без воды довести общий объем до 310 мкл.
  2. Сплит этой реакционной смеси на две трубы из 155 мкл каждого из них.
  3. Затем добавить 30 единиц, или 3 мкл, Т4-β-glucosyltransferase к одной трубке. Хорошо перемешайте, аккуратно пипетирования вверх и вниз. Вторая трубка контрольной реакции, так что добавьте 3 мкл воды, вместо того, Т4-BGT.
  4. Инкубируйте обе трубки на 37 градусов по Цельсию в течение 12 до 18 часов, в течение которых Т4-BGT добавят глюкозы гидроксильные группы 5-hydroxymethylcytosine групп в образце.

2. Пищеварение рестрикции

  1. Этикетка три 0,2 мл ПЦР-полосы трубы цифры от 1 до 3. Алиготе 50 мкл реакционной смеси в каждую.
  2. Этикетка три 0,2 мл ПЦР-полосы трубы номера с 4 по 6. Алиготе 50 мкл контроля смесь в каждом.
  3. Добавить 100 единиц, или на 1 мкл, из MspI в пробирки 1 и 4. Хорошо перемешайте, аккуратно пипетирования вверх и вниз.
  4. Добавить 50 единиц, или на 1 мкл, из HpaII в пробирки, 2 и 5. Хорошо перемешайте, аккуратно пипетирования вверх и вниз.
  5. Не добавляйте ничего, чтобы трубы 3 и 6, так как они являются элементами управления.
  6. Инкубируйте всех 6 труб при температуре 37 градусов по Цельсию в течение не менее 4 часов.
  7. Добавить 1 мкл протеиназы К в каждую пробирку и инкубировать при температуре 40 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
  8. Инактивировать протеиназы К путем инкубации при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут.

3. Анализ ДНК методом ПЦР / КПЦР

Этот протокол использует NEB в LongAmp Taq для конечной точки ПЦР, который был проявлен к хорошей работе. Другие протоколы ПЦР могут быть заменены.

  1. Добавьте следующие компоненты в 0,2 мл ПЦР-реакции пробирку на льду: 10 мкл 5X LongAmp Taq реакционного буфера, 1,5 мкл 10 мМ дНТФ, 1 мкл 10 мкмоль прямого праймера, 1 мкл 10 мкмоль Primer назад, 3 мкл шаблон ДНК из предыдущих шагов, 1 микролитр LongAmp ДНК-полимеразы Taq и нуклеазы без воды до 50 мкл. Эти объемы могут меняться в зависимости от используемого протокола ПЦР.
  2. Аккуратно перемешайте реакции. При необходимости собрать все жидкости в нижней части трубы быстро вращаться.
  3. Наложение образца с минеральным маслом при использовании амплификаторе без подогревом крышкой.
  4. Передача пробирки для ПЦР изо льда в Термоциклер с блока предварительно нагретую до 94 градусов по Цельсию и начать езда на велосипеде программы. Для рутинной 3-х ступенчатый ПЦР, должен быть один первый шаг денатурации при 94 градусах Цельсия в течение 30 секунд, затем 30 циклов 94 градусов Цельсия денатурации в течение 15 секунд, от 55 до 65 градусов Цельсия отжига в течение 30 секунд, и 65 градусов по Цельсию расширение в течение 20 секунд, или 50 секунд кб. Это должно сопровождаться одним последним продлением на 65 градусов по Цельсию в течение 5 минут. ПЦР в реальном времени также может быть выполнена для количественного определения количества 5-метилцитозин и 5-hydroxymethylcytosine. Пожалуйста, ознакомьтесь с руководством по продукции, найденный на neb.com конкретной информации.

4. Представитель Результаты:

Рисунок 1
Рисунок 1. Сравнение 5-hydroxymethylcytosine суммы в локусе 12 в другую мышь Balb / C образцы тканей. (А), конечного точки ПЦР. (B), ПЦР в реальном времени.

ДНК из четырех тканях мышей были проанализированы. Для сравнения, ПЦР в реальном времени данные были нормированы на режиссерский ДНК. Стандартная кривая была использована для определения количества копий. Образцы могут быть нормализованы путем деления количества копий образцов не по 1-6 числа копий управления, непереваренные (№ 5). Штучной упаковке полосы геля показано изменение в 5-HMC настоящее время.

Обсуждение

Есть несколько важных вещей, чтобы рассмотреть при создании этого эксперимента. Во-первых, важно, чтобы glucosylation геномной ДНК переходит к завершению. Последовательность Специфичность Т4-BGT не известно, и это, кажется, нет другого выбора, для подложки последовательности. Поэтому в некоторых случаях более длительное время инкубации может быть необходимым. Во-вторых, MspI и HpaII пищеварения должна быть полной, чтобы избежать фонового сигнала. Для этих ферментов рестрикции, мы рекомендуем инкубации в течение 4 часов, но больше инкубации могут быть выполнены при неполном расщеплении наблюдается. В-третьих, количество входных ДНК может быть скорректирован в зависимости от доступности, с 20 NGS ДНК может быть использована для конечной точки ПЦР. Наконец, мы рекомендуем использовать поставляемые контроль ДНК, которые могут работать параллельно с геномной ДНК в течение 5-MC и 5-HMC количественной оценке.

Раскрытие информации

Оба Тед и цыгане, авторы этой статьи, являются сотрудниками NEB; рома является главным разработчиком комплекта, с Тедом будучи директором Приложения и департамента развития, который курировал разработку этого набора.

Благодарности

Sriharsa Прадхан, Шеннон Мори Кинни, Hang Gyeong Чин, Юрате Bitinaite, Ю. Чжэн, Пьер Оливье Esteve, Ромуальдас Vaisvila, лабораторные Стивен Э. Якобсен с, Лос-Анджелесе. Эта работа была частично поддержана NIH 1R44GM095209-01.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для анализа 5-hmC и 5-mC EpiMark™New England BiolabsE3317
Локус-специфические праймеры, фланкирующие интересующий сайт CCGGИндивидуально для каждого эксперимента; предоставляются пользователем
ДНК-полимераза LongAmp® TaqNew England BiolabsM0323
dNTPNew England BiolabsN0447
вода для молекулярно-биологических исследований

Ссылки

  1. Sadri, R. Nucleic Acids Res. 24, 4987-4989 (1996).
  2. Mathur, E. J. Gene. 108, 1-6 (1991).
  3. Butkus, V., Petrauskiene, L., Maneliene, Z., Klimasaukas, S., Laucys, V., Janulaitis, A. Nucleic Acids Res. 15, 7091-7102 (1987).
  4. Kriaucionis, S., Heintz, N. Science. 324, 929-930 (2009).
  5. Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. Science. 324, 930-935 (2009).
  6. Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. PLoS One. 5 (1), e8888-e8888 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

EpiMark 5 hmCMspI HpaII

Похожие статьи