Препарирование и обработка изображений активных зон в Drosophila Нервно-мышечном соединении

Краткое содержание

Нервно-мышечном соединении (NMJ) из Дрозофилы Является важной модельной системой для изучения нормальной синаптической функции, а также возмущения в синаптической функции найдены в некоторых неврологических заболеваний. Мы представляем протокол вскрытия Drosophila Личиночной-двигательного аппарата и иммуногистохимическое активных белков зоны в NMJ.

Аннотация

Нервно-мышечный синапс (NMJ) личинок Drosophila является отличной моделью для изучения структуры и функции синапсов. Drosophila широко известна простотой проведения мощных генетических манипуляций, а нервная система личинок оказалась особенно полезной при изучении не только нормального функционирования, но и нарушений, сопровождающих некоторые неврологические заболевания (Lloyd and Taylor, 2010). Многие ключевые синаптические молекулы, обнаруженные у Drosophila, также присутствуют у млекопитающих; подобно большинству возбуждающих синапсов ЦНС млекопитающих, NMJ Drosophila является глутаматергическим и проявляет активность-зависимое ремоделирование (Kohet al. , 2000). Кроме того, нейроны Drosophila можно идентифицировать по отдельности, поскольку паттерны их иннервации стереотипны и повторяемы, что позволяет изучать конкретные синаптические терминали, например, те, что расположены между моторными нейронами и иннервируемыми ими мышечными волокнами стенки тела (Keshishian and Kim, 2004). Наличие эволюционно консервативных компонентов синапса в сочетании с простотой генетических и физических манипуляций делает модель Drosophila идеальной для исследования механизмов, лежащих в основе синаптической функции (Budnik, 1996).

Активные зоны синаптических окончаний представляют особый интерес, так как именно в этих местах происходит высвобождение нейромедиаторов. NC82 — это моноклональное антитело, которое распознает белок Bruchpilot (Brp) Drosophila, члена семейства CAST1/ERC, являющийся важным компонентом активной зоны (Waghet al. , 2006). Было показано, что Brp непосредственно формирует Т-образную перекладину (T-bar) активной зоны и отвечает за эффективное кластерирование каналов Ca²⁺ под плотностью T-bar (Fouquetet al. , 2009). Мутанты Brp характеризуются сниженной плотностью каналов Ca²⁺, подавленным вызванным выбросом везикул и измененной краткосрочной пластичностью (Kittelet al. , 2006). Изменения активных зон наблюдались в моделях заболеваний на Drosophila. Например, иммунофлуоресцентный анализ с использованием антитела NC82 показал, что плотность активных зон была снижена в моделях бокового амиотрофического склероза и синдрома Питта-Хопкинса (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Таким образом, оценка активных зон или других синаптических белков в моделях заболеваний на личинках Drosophila может дать ценную первичную подсказку о наличии синаптического дефекта.

Подготовка целых диссецированных личинок Drosophila для иммунофлуоресцентного анализа НМС требует определенного навыка, однако большинство исследователей могут освоить этот метод после небольшой практики. В данной работе представлен способ, позволяющий проводить диссекцию и иммуноокрашивание нескольких личинок в одной чашке, что сводит к минимуму различия в условиях окружающей среды для каждого генотипа и обеспечивает достаточное количество животных для подтверждения воспроизводимости и проведения статистического анализа.

Протокол

1. Подготовка к иммунофлуоресценции:

1. Чтобы создать рассекает поверхность, залить 184 Sylgard силиконового эластомера базы в небольшую тарелку культуры ткани. Удостоверьтесь, чтобы не заполнить пластины полностью, так что вскрытие области ниже, чем обод.
2. Trim рассечение булавками к длине приблизительно 3,5 мм для повышения простоты манипуляций, и убедитесь, что по крайней мере 6 штырьков в личинку.
3. Вам нужно будет тупой пинцет, который позволит вам понять булавки для вскрытия.

2. Препарирование Личинки:

1. Выберите блуждающих третьего возраста личинок, которые ползают по бокам флакона и не начали окукливаются.
2. Место личинки на вскрытие поверхности под стереомикроскопа. Вика излишки влажных использованием Kimwipe.
3. Упорядочить каждой личинки, так что спинной стороной вверх. Вы сможете увидеть два трахеи, белые линии вдоль спинной стороны личинки. Попробуйте центра них в среднем как можно больше, потому что это знаменует собой спинной средней линии.
4. Место контакт номер 1 чуть выше устья крючка (рис. 1).
5. Место контакт номер 2 в хвост чуть выше дыхальца между трахеи.
6. Добавить небольшое количество PBS, чтобы личинки, чтобы предотвратить высыхание кутикулы.
7. Повторите эти шаги со всеми личинки, убедившись, что генотипы разделены пространственно путем размещения контактных между генотипом.
8. Сделать небольшие поперечные право голову выше вывод № 2 на обоих трахеи (рис. 1).
9. Вставьте ножницами в первый разрез и разрез по средней линии спинной между трахеи все, вплоть до прошлого контакт номер 1.
10. Вам нужно будет делать другие небольшие порезы на самом верху и внизу каждой стороны кутикулы, таким образом, чтобы левая и правая стороны откроется позволяет прикрепить их без потянув за кутикулой.
11. Место контактный # 'ы 3, 4, 5 и 6 на каждом углу.
12. Fix образца с 4% PFA в течение 20-25 минут при комнатной температуре
13. Декантируйте PFA и промыть 3-4 раза PBS, разливая каждый раз.

3. Удаление ткани:

1. Начните с удаления тканей на заднем конце, потому что обычно вы хотите защитить область, где мозг находится.
2. При использовании steromicroscope и с личинками под капли PBS, во-первых захватить задним концом одного из трахеи и вытащить его, которые могут удалить часть жира в организме с ним. Повторите эти действия для второго трахеи.
3. Захватите некоторые задним жира или кишечника и вытащить их из преп. Как только большая часть задней ткань была удалена, сосредоточиться на устранении небольших тканей, окружающих мозг. Если вы заинтересованы только в мышцах, или морфологию NMJ можно удалить мозга, а также.
4. Удаление мозга позволяет улучшить визуализацию мышцы 31, который является полезным маркером брюшной ориентации сегменте.

4. Иммунофлуоресценции для активных зон:

1. Добавить блокирующий агент (5% нормальной сыворотки козьего в ПБС) для расчлененный подготавливает в рассечение блюдо. Блок в течение 1 часа при комнатной температуре. Если вы хотели бы сделать только одно решение для блокировки и разведения антител, включают 0,1% TritonX-100 к блокирующий агент для ткани пермеабилизации.
2. Применить Первичные антитела разводят в блокирующий реагент с 0,1% TritonX-100. Активные антитела зоны достигается через развитием исследований Гибридома банк (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/). Используйте ссылки антитела (например пероксидазой хрена Cy3 сопряженным) к этикетке мембраны NMJ и аксонов.
3. Инкубируйте первичных антител при 4 ° С в течение ночи. Так что сухость холодильник не будет испаряться раствор антитела, создать камере влажности, положив немного воды в нижней части окна использовали наконечник пипетки. Обложка полупрозрачная крышка с алюминиевой фольгой, чтобы уменьшить флуоресцентные отбеливания. Место вскрытия слайда в камере влажности и положить целую коробку в 4 ° C инкубаторе на ночь.
4. Следующим утром, промыть PBST (PBS с 0,2% Triton-X-100) 5-10 раз в течение 5-10 минут каждый.
5. Инкубируйте с вторичными антителами (например, Invitrogen Alexa антимышиного-488) разводят в блокирующий реагент с 0,1% TritonX-100 при комнатной температуре на 2-4 часа в закрытой камере влажности. Включите ядерной пятна (например, DAPI) на вторичном, если вы хотите определить местоположение ядра в мышцы или мозга.
6. Промыть PBST (PBS с 0,02% Тритон-Х-100) 5-10 раз в течение 5-10 минут каждый.

5. Монтаж личинок Образцы на слайдах:

1. Декантировать и фитиль от последнего мыть PBST.
2. Внесите примерно 1 мл 80% глицерина, чтобы покрыть придавленный личиночных шкурок.
3. Удалите 5 из 6 контактов во всех личинок.
4. Когда вы будете готовы поставить первый генотип на слайде удалить последний вывод для всех личинок, что genotyре.
5. Подготовка "мыть" слайд, поместив две капли вашей установки среды на чистую слайда. Этот шаг важен, мыть водным раствором с личинками для монтажа и четкие изображения.
6. Захватите одну личинку за хвост с тупым пинцетом, перетащите вокруг личинки в глицерина, а затем по сухой краев рассечение блюдо, снять большинство глицерина. Место личинок в первые монтажа среду капли.
7. Повторите шаг 6 для всех личинок одного и того же генотипа.
8. После того как все личинки в первом монтаже среду падение, схватить первый личинка за хвост и тянуть его через падение и затем по сухой краям блюда, чтобы удалить большинство среде. Затем поместите личинки во второй монтажа среду капли.
9. Повторите шаг 8 для всех личинок с тем же генотипом.
10. Подготовьте свой заключительный слайд, назвав его и размещения малых "Т" формы монтажа среды на слайде.
11. Как и в шаге 5.8, захватить личинка за хвост, тянуть шкуру через второй монтажа падение средних и затем по сухой стороны "Мойте" слайда. После большинство среде оторваться, место личиночной шкуру на окончательный слайд в монтажной средой.
12. Повторите эти действия для всех личиночных шкурок.
13. Убедитесь, что все личиночные шкуры расположены как хотелось бы убедиться, что кутикула стороной вниз и подвергается мышца вверх.
14. Место покровным стеклом на слайде, чтобы покрыть расчлененный личинки, с начала краю в верхней строке "Т."
15. Положите небольшой вес (например, 9-вольтовой батареи) на покровное стекло, убедившись, что монтаж среду распространяется полностью под покровным стеклом.
16. Для снижения возможных флуоресцентные закалки, место слайда в ящик или темное пространство до монтажа среде вылечить.
17. Очистка монтажа среда, которая переполнена краями покрытия скольжения. Очистите избыток сухого монтажа среды на скольжение крышкой или слайд с 70% этанола.
18. Чтобы создать окончательный печать, печать с ногтей.

6. Представитель Результаты:

Например слайд расчленены и immunostained личинок показано на рисунке 2. Когда личинки вскрытия, пятна, и монтаж выполняются должным образом, пользователь может определить личинки мышц интереса (рис. 3) в сегментах А2-А6. Хоанг и соавт. Предусматривает подробное описание мышц позиции, а также характеристик конкретных синаптических boutons (Хоанг и Тиба, 2001). Использование высоких целей власть пользователь может сосредоточиться на одном синапсе и принять Z-Stack изображения. Проекция представитель максимальной образ части синапса 6 / 7 Показано (рис. 4). Затем, используя для обработки изображений, активные зоны могут быть количественно оценены характеристики, которые свойственны для вашего мутантного фенотипа. Примеры функций, которые могут быть изменены в частности мутантного фенотипа включают общее количество, flourescence интенсивности, а расстояние между активными зонами.

Потенциальные ловушки:

Иммунофлуоресценции оценки личиночной соединения нервно-мышечной является ценным системы, которые могут предоставить ценную информацию о синаптической биологии, хотя Существуют потенциальные проблемы, которые могут ограничить полезность этой системы. Например, часто желательно изображение окрашивания узор из двух или более первичных антител в одном образце. Выбор соответствующих первичных антител, соответствующие флуорофоров, а также соответствующие отрицательного контроля имеет важное значение для успеха.

Если изображение двух антигенов в эксперименте, быть уверенным, что первичные антитела из разных видов, так что каждый белок может быть однозначно идентифицированы с флуоресцентно меченых вторичных антител. Рекомендуемый способ уменьшить фон является использование блокаторов содержащих нормальную сыворотку видов, от которых вторичные антитела были получены (например, использование нормальной козьей сывороткой, как блокирующий агент при использовании козьего анти-кролика или анти-мышь вторичного антитела).

После планирования первичного и вторичного антитела, которые вы будете использовать в своем эксперименте, необходимо также рассмотреть вопрос о включении управления в окрашивании наборов для того, чтобы флуоресцентный сигнал, что вы видите, это реальная, а не просто фоном. Если это возможно, включать отрицательные контрольные образцы, не содержащие белок. Это легко сделать при изучении экзогенных экспрессией трансгенов, включив дикое животное типа, но в некоторых случаях может быть достигнуто с помощью гомозиготных мутантов вашего белок. Другой существенный отрицательный контроль, полезные для измерения фоновых уровней вашей флуоресцентный сигнал, заключается в использовании вторичного антитела, не включая первичные. При визуализации вашего результате подготавливает, важно понимать, что все флуоресцентный сигнал, что вы видите, не может быть реальным, и может быть фоном от до летУра вторичными антителами или из эндогенных фоне ткани. Вам может понадобиться для нормализации изображений рассмотреть фоновой флуоресценции, когда опробование для изменения между интенсивности флуоресценции.

Выбор флуорофора также должно быть сделано с большой осторожностью. Рассмотрение возбуждения и спектры излучения для каждого флуорофора и возможность однозначно обнаружения каждого сигнала необходимо, чтобы избежать кровотечения через канал. Если есть неопределенность, простой способ определить, является ли степень кровоточить через это immunostain с одного флуорофора меченых антител в то время, и проверить, изображение с каждого канала, который вы будете использовать в своей окончательной эксперимента. Это должно выявить, если кровотечение происходит через с микроскопом набор фильтров.

Рисунок 1. Блок-схема обрезания кутикулы и размещение контактов 1-6. Щелкните здесь для просмотра больших изображений

Рисунок 2. Размещение личинок на заключительный слайд. Убедитесь, что личинки подвергаются подготавливает мышцы вверх и кутикулы стороной вниз. Оставьте как минимум личиночной ширина тела в промежутке между каждого образца.

Рисунок 3. Когда изображения, найдите мышцы и сегментов, представляющих интерес. Общие нервно-мышечных контактов характеризуется иннервируют мышцы 6 / 7, 13 мышц, мышечные 12, или мышцы 4. На противоположной стороне брюшной средней линии, есть мышцы зеркальным отражением структуры показали геми-сегменте. Используйте мышцы 31 в качестве маркера для определения, какой сегмент вы изображений. Изображение же синапсов и сегменты для остальных ваших образцов, собирая много синаптических изображений в генотипе, которые могут быть использованы для количественной оценки.

Рисунок 4. Представителем проецирования изображения максимум часть NMJ иннервирующих мышцы 6 / 7 показан. NC82 (Bruchpilot) окрашивания показана зеленым цветом. HRP пресинаптических пятно отображается красным цветом. Обратите внимание на активную punctae зоны, которая может быть дополнительно количественно с помощью ПО для обработки изображений.

Обсуждение

Для нейронов, синаптических площадь терминала имеет решающее значение, и является мостом для надлежащей связи между пост-и пресинаптических клетках. Эффективный способ исследовать здоровье нейронов при болезни моделей для анализа белков синаптических терминала иммунофлюоресценции. Иммунофлуоресценции метод, представленный здесь позволяет исследователю изучить много личинок одновременно ограничивая при этом экологических различий между группами. Центральной нервной системы дрозофилы третьего возраста личинок име...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Sylgard 184 силиконового эластомера базы	Dow Corning	68037-59-2	После смешивания позволяет пузыри медленно подниматься, помещая на медленном ротатор или позволять, чтобы сидеть в течение 30 минут или больше.
Нержавеющая сталь Minutien Pins	Инструменты изобразительных наук	26002-10	Обрезать до ок. 3-4мм в длину с регулярными ножницами
Ламинэктомия Пинцет (Блант-Используется для захвата контакта)	Изобразительных инструментов науки	11223-20	Использование в качестве тупого щипцы для захвата контакты
Препарирование Пинцет	Инструменты Всемирного Precision	501985
SuperFine Vannas Ножницы, 8 см долго	Инструменты Всемирного Precision	501778
Мышь против Вр антител	DSHB	NC82	Используйте 1:50 разбавления
Cy3 Affinipure Коза по борьбе с пероксидазой хрена	Джексон Immunoresearch	123-165-021	Использование в разведении 1:200
Alexa Fluor 488 антимышиного IgG	Invitrogen	A11001	Используйте ок. 1:200 разбавления