Препарирование и обработка изображений активных зон в Drosophila Нервно-мышечном соединении

Краткое содержание

Нервно-мышечном соединении (NMJ) из Дрозофилы Является важной модельной системой для изучения нормальной синаптической функции, а также возмущения в синаптической функции найдены в некоторых неврологических заболеваний. Мы представляем протокол вскрытия Drosophila Личиночной-двигательного аппарата и иммуногистохимическое активных белков зоны в NMJ.

Аннотация

Нервно-мышечный синапс (NMJ) личинок Drosophila является отличной моделью для изучения структуры и функции синапсов. Drosophila широко известна простотой проведения мощных генетических манипуляций, а нервная система личинок оказалась особенно полезной при изучении не только нормального функционирования, но и нарушений, сопровождающих некоторые неврологические заболевания (Lloyd and Taylor, 2010). Многие ключевые синаптические молекулы, обнаруженные у Drosophila, также присутствуют у млекопитающих; подобно большинству возбуждающих синапсов ЦНС млекопитающих, NMJ Drosophila является глутаматергическим и проявляет активность-зависимое ремоделирование (Kohet al. , 2000). Кроме того, нейроны Drosophila можно идентифицировать по отдельности, поскольку паттерны их иннервации стереотипны и повторяемы, что позволяет изучать конкретные синаптические терминали, например, те, что расположены между моторными нейронами и иннервируемыми ими мышечными волокнами стенки тела (Keshishian and Kim, 2004). Наличие эволюционно консервативных компонентов синапса в сочетании с простотой генетических и физических манипуляций делает модель Drosophila идеальной для исследования механизмов, лежащих в основе синаптической функции (Budnik, 1996).

Активные зоны синаптических окончаний представляют особый интерес, так как именно в этих местах происходит высвобождение нейромедиаторов. NC82 — это моноклональное антитело, которое распознает белок Bruchpilot (Brp) Drosophila, члена семейства CAST1/ERC, являющийся важным компонентом активной зоны (Waghet al. , 2006). Было показано, что Brp непосредственно формирует Т-образную перекладину (T-bar) активной зоны и отвечает за эффективное кластерирование каналов Ca²⁺ под плотностью T-bar (Fouquetet al. , 2009). Мутанты Brp характеризуются сниженной плотностью каналов Ca²⁺, подавленным вызванным выбросом везикул и измененной краткосрочной пластичностью (Kittelet al. , 2006). Изменения активных зон наблюдались в моделях заболеваний на Drosophila. Например, иммунофлуоресцентный анализ с использованием антитела NC82 показал, что плотность активных зон была снижена в моделях бокового амиотрофического склероза и синдрома Питта-Хопкинса (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Таким образом, оценка активных зон или других синаптических белков в моделях заболеваний на личинках Drosophila может дать ценную первичную подсказку о наличии синаптического дефекта.

Подготовка целых диссецированных личинок Drosophila для иммунофлуоресцентного анализа НМС требует определенного навыка, однако большинство исследователей могут освоить этот метод после небольшой практики. В данной работе представлен способ, позволяющий проводить диссекцию и иммуноокрашивание нескольких личинок в одной чашке, что сводит к минимуму различия в условиях окружающей среды для каждого генотипа и обеспечивает достаточное количество животных для подтверждения воспроизводимости и проведения статистического анализа.

Протокол

1. Подготовка к иммунофлуоресценции:

1. Чтобы создать рассекает поверхность, залить 184 Sylgard силиконового эластомера базы в небольшую тарелку культуры ткани. Удостоверьтесь, чтобы не заполнить пластины полностью, так что вскрытие области ниже, чем обод.
2. Trim рассечение булавками к длине приблизительно 3,5 мм для повышения простоты манипуляций, и убедитесь, что по крайней мере 6 штырьков в личинку.
3. Вам нужно будет тупой пинцет, который позволит вам понять булавки для вскрытия.

2. Препарирование Личинки:

1. Выберите блуждающих третьего возраста личинок, которые ползают по бокам флакона и не начал....

Обсуждение

Для нейронов, синаптических площадь терминала имеет решающее значение, и является мостом для надлежащей связи между пост-и пресинаптических клетках. Эффективный способ исследовать здоровье нейронов при болезни моделей для анализа белков синаптических терминала иммунофлюоресценции. Иммунофлуоресценции метод, представленный здесь позволяет исследователю изучить много личинок одновременно ограничивая при этом экологических различий между группами. Центральной нервной системы дрозофилы третьего возраста личинок име.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Sylgard 184 силиконового эластомера базы	Dow Corning	68037-59-2	После смешивания позволяет пузыри медленно подниматься, помещая на медленном ротатор или позволять, чтобы сидеть в течение 30 минут или больше.
Нержавеющая сталь Minutien Pins	Инструменты изобразительных наук	26002-10	Обрезать до ок. 3-4мм в длину с регулярными ножницами
Ламинэктомия Пинцет (Блант-Используется для захвата контакта)	Изобразительных инструментов науки	11223-20	Использование в качестве тупого щипцы для захвата контакты
Препарирование Пинцет	Инструменты Всемирного Precision	501985
SuperFine Vannas Ножницы, 8 см долго	Инструменты Всемирного Precision	501778
Мышь против Вр антител	DSHB	NC82	Используйте 1:50 разбавления
Cy3 Affinipure Коза по борьбе с пероксидазой хрена	Джексон Immunoresearch	123-165-021	Использование в разведении 1:200
Alexa Fluor 488 антимышиного IgG	Invitrogen	A11001	Используйте ок. 1:200 разбавления