ampliPHOX колориметрических технологии обнаружения представлена как недорогая альтернатива флуоресценции обнаружения микрочипов. На основе фотополимеризации, ampliPHOX производит твердые пятна полимера видна невооруженным глазом в течение нескольких минут. Результаты затем отображаемого и автоматически интерпретировать с простой, но мощный пакет программного обеспечения.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
ampliPHOX Колориметрические обнаружения на ДНК-микрочипов по гриппу
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
ДНК-микрочипы стали мощным инструментом для обнаружения патогенов.1-5 Например, было продемонстрировано множество примеров возможности типирования и субтипирования вируса гриппа.6-11 Идентификация и субтипирование гриппа с помощью ДНК-микрочипов находят применение как в общественном здравоохранении, так и в клинической практике для раннего обнаружения, оперативного вмешательства и минимизации последствий пандемии гриппа. Традиционная флуоресценция в настоящее время является наиболее распространенным методом детекции микрочипов. Однако по мере развития технологии микрочипов в сторону клинического применения1 замена дорогостоящего оборудования недорогими технологиями детектирования, обладающими характеристиками эффективности, аналогичными флуоресценции, сделает анализ с помощью микрочипов более привлекательным и экономически эффективным.
Технология колориметрического детектирования ampliPHOX предназначена для исследовательских целей; ее предел обнаружения находится в пределах одного порядка от традиционного флуоресцентного метода11, при этом основным преимуществом является примерно в десять раз более низкая стоимость оборудования по сравнению с конфокальными сканерами микромассивов, необходимыми для флуоресцентного детектирования. Другим преимуществом является компактный размер прибора, который обеспечивает портативность и гибкость в использовании, в отличие от традиционных флуоресцентных приборов. Однако, поскольку технология полимеризации не является столь линейной по своей сути, как флуоресцентное детектирование, она лучше всего подходит для применения в микромассивах с низкой плотностью, где требуется ответ «да/нет» о наличии определенной последовательности, например, в массивах для обнаружения патогенов. На данный момент максимальная плотность пятен, совместимая с детектированием ampliPHOX, составляет ˜1800 spots/array. Из-за ограничений по плотности пятен микромассивы с более высокой плотностью не подходят для детектирования методом ampliPHOX.
В данной работе мы представляем технологию колориметрического детектирования ampliPHOX как метод усиления сигнала на микромассиве низкой плотности, разработанном для обнаружения и характеристики вирусов гриппа (FluChip). Хотя в данном протоколе FluChip (ДНК-микромассив) используется как один из конкретных вариантов применения детектирования ampliPHOX, любой микромассив, включающий биотинилированную мишень, может быть маркирован и обнаружен аналогичным образом. Разработка дизайна микромассива и биотинилирование захватываемой мишени осуществляются пользователем. После захвата биотинилированной мишени на массиве детектирование с помощью ampliPHOX может быть выполнено путем предварительной маркировки массива конъюгатом на основе стрептавидина (ampliTAG). При воздействии света с помощью прибора ampliPHOX Reader происходит полимеризация раствора мономера (ampliPHY) только в областях, содержащих мишени, маркированные ampliTAG. Образовавшийся полимер можно впоследствии окрасить нетоксичным раствором для улучшения визуального контраста с последующей визуализацией и анализом с помощью простого программного пакета (ampliVIEW). Весь анализ FluChip — от неэкстрагированного образца до получения результата — может быть выполнен примерно за 6 часов, а описанные выше этапы детектирования ampliPHOX могут быть завершены примерно за 30 мин.
Протокол
1. Примеры усиления использованием RT-PCR
- Выделите вирусную РНК из клинического материала или вирусной изолировать использованием вирусов Qiagen MinElute Спиновые Kit в сочетании с автоматизированной QIAcube нуклеиновые кислоты платформы добычи. Экстракция выполняется на 200 мкл образца с конечного объема элюции 60 мкл. Магазин экстрактов при -70 ° С или ниже для дальнейшего использования.
- В шаблоне свободной области, подготовить RT-PCR Master Mix на льду в соответствии с протоколом производителя. Чтобы включить биотина в течение RT-PCR, используйте смесь биотинилированного дНТФ вместо производителя поставляются дНТФ смеси. Стоимость использования биотинилированного смесь дНТФ меньше, чем $ 1 USD / анализа. Альтернативные методы биотин включения, такие как использование биотинилированного грунтовка также может быть использован. Добавить грунтовки смеси при конечных концентрациях 1,0 мкМ для гриппа, 1,0 мкМ для гриппа В, и 0,14 мкМ для внутреннего контроля. Грипп грунтовки набор усиливает сегмент матрицу гена (1032 п продукт) и гриппа B набор грунтовка усиливает неструктурных генов сегмента (811 нт продукта). Каждый набор содержит FluChip грунтовки одного праймера с 5 'фосфорильной группы для облегчения поколения одноцепочечной ДНК с помощью ферментативного расщепления с лямбда экзонуклеазная следующих ПЦР. В результате одноцепочечной продукт требует гораздо меньше времени, чем гибридизации двухцепочечную эквивалента и значительно сокращает общее время анализа. Предварительно приготовленной смеси из этих праймеров, а также внутреннюю РНК шаблон управления доступны из InDevR заинтересованных научных работников на ограниченной основе.
- Кратко вихря и распределять 18 мкл мастер смеси в тонкостенных труб ПЦР.
- Передача трубок на лед, чтобы подходящее место работы для того шаблона, и добавьте 2 мкл шаблон для каждой реакции трубки.
- Передача пробирки для ПЦР в термоциклер, и выполните следующие тепловые Профиль обратной транскрипции при 50 ° С в течение 30 мин, инактивации фермента / активации при температуре 95 ° С в течение 15 мин, 40 циклов ПЦР составляет 95 ° С в течение 30 с, 55 ° С в течение 30-х и 72 ° С в течение 1 мин, а окончательное расширение при 72 ° С в течение 10 мин.
2. Гибридизация ПЦР-продукты с низкой плотностью микрочипы
- В целях получения одноцепочечной ДНК для FluChip гибридизации, готовят смесь ферментативного пищеварения, комбинируя 1,0 мкл фермента экзонуклеазная лямбда, 2,2 мкл буфера сопровождающих реакцию, и 0,8 мкл нуклеазы без воды. Эти суммы для одного образца, но может быть просто масштабируется для общего количества проб, чтобы быть переварены. Удалить образцы термоциклер и добавьте 4 мкл приготовленной смеси для каждой реакции переварить фосфорилированных прядь продукта ПЦР. Вернуться образцы термоциклер и программы термоциклер до 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут, затем на 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут для завершения ферментативного пищеварения и шаги тепла фрагментации.
- Пользовательских микрочипов гриппа использоваться печатаются на альдегид функционализированных слайды стекла прикладной Microarrays Inc (Темпе, штат Аризона). 5'-амино прекращено последовательности захвата в сочетании с оптимизированной кровянистые выделения буфера и напечатаны в конечной концентрации 20 мкМ (за исключением прямой последовательности управления, которая дополнительно имеет 3'-биотин модификации и выставляется в конечной концентрации 500 нМ) . Бесконтактного кровянистые выделения метод, с оптимальным диаметром пятна 300 мкм и от центра до центра шагом 700 мкм.
- Удалить из микрочипов ящик для хранения и применения одноразовых скважин гибридизации вокруг микрочипов, удалив защитный лист и нажимая твердо вокруг хорошо периметру.
- Место слайдов мыть бен содержащих 110 мл очищенной воды на 5 минут предварительно гибридизации смойте орбитальный шейкер на 60-90 оборотов в минуту. Сухой массив, слегка касаясь ткани стеклоочистителя на край колодца и позволяет воде быть злой прочь.
- Комбинат 22 мкл 2х буфера гибридизации с каждым из фрагментированных продуктов оцДНК и пипеткой 40 мкл гибридизации решений в микрочипов скважин.
- Разрешить слайды к гибридизации в закрытой камере влажности в течение 60 минут.
- Удалить слайды из камере влажности, кратко ополосните массивов с промывочного буфера D в ополосните бутылку прежде чем положить в слайд стойку. Обычно промывку объем промывочного буфера D составляет 2 мл на массив. Место слайд стойку содержащих слайды в мытье бен содержащих 110 мл промывочного буфера А. Место бен на орбитальном шейкере при 60-90 оборотов в минуту в течение 1 минуты.
- Удалить слайд стойки из промывочного буфера, кратко промыть промывочного буфера D, передача слайд стойку, чтобы бен содержащие B промывочный буфер, и пожать на 60-90 оборотов в минуту в течение 5 минут.
- Аккуратно сухой массив на каждом слайде, и место сушеные слайдов в камере влажности при подготовке шаги ampliPHOX колориметрический Detection.
3. ampliPHOX: маркировка гибридизированных и калибровку продукции чипов с ampliTAG
- Объединять 10 мкл ampliTAG, 20 мкл 2х буфера ampliTAG и 10 мкл очищенной воды для каждого массива, подлежащих обработке. Реагент объемы могут быть просто масштабируется для общего количества проб. Убедитесь в том, чтобы подготовить достаточно смеси маркировки для учета всех образцов массивы массивов и калибровки необходимо. Число калибровочных чипов необходимо зависит от того, вы выполняете полную калибровку (для нового документа или новой партии реагентов), или просто инструмент проверки. Для полной калибровки, 3 фишки калибровки, должны быть маркированы, и для реагента проверить, только один чип калибровки, должны быть маркированы. Пожалуйста, обратите внимание, что до калибровки массивы помечены, они должны пройти через предварительно гибридизации стиральной шаг, который ранее был описан для гриппа массивов.
- Передача 40 мкл этикетке смеси каждого массива и позволяют маркировки протекания реакции в закрытой камере влажности в течение 5 минут.
- Немедленно промойте массивов с промывочного буфера D в ополосните бутылку до размещения слайдов в слайд стойку. Трансфер в стойку бен содержащих 110 мл промывочного буфера C, и пожать на 60-90 оборотов в минуту в течение 5 минут.
- Использование второго бен мыть с водой очищенной, выполнить три последовательных кратких провалы водой, чтобы удалить соль остатка. Сухой массивов, слегка касаясь ткани стеклоочистителя к краю скважин.
- Микрочипы теперь правильно помечены ampliTAG, а остальная часть процедуры обнаружения ampliPHOX может быть выполнена. Фотоактивация и обработки изображений меченых массивы должны быть завершены в течение 24 часов, а также дополнительные массивы могут быть сохранены в темном поле слайда до использования.
4. ampliPHOX: калибровка, усиления сигнала и изображения
- Включите ampliPHOX читателя и обеспечить ampliVIEW программное обеспечение готово к фотоактивации.
- Определить оптимальное время фотоактивации использованием калибровочных чипов. В дополнение к кратким введением, которое следует, эта процедура также подробно описан в ручном режиме ampliPHOX. Калибровки чипы содержат ряд разведений биотинилированного последовательного управления, которые используются для оптимизации чувствительности анализа, с целью максимизации числа строк калибровки чипа, которые производят положительный сигнал, как определено программного обеспечения.
- Удалить ampliPHY от 4 ° C, позволяют нагреться до комнатной температуры, и вихрь коротко перемешать. Внесите 3 мкл ampliPHY усилитель в ampliPHY флаконе, и вихревые тщательно в течение 10 секунд.
- Равномерно передачи 40 мкл раствора в ampliPHY микрочипов и содержащие ampliTAG меченных массив, гарантирующий, что ни пузырьков присутствуют. Закройте флакон ampliPHY между каждым приложением. Вставьте слайд микрочипов в фотоактивации бухте чтения ampliPHOX.
- Для первого массива калибровку, использовать время по умолчанию фотоактивации в 'Time' окно на панели левой программного обеспечения, и нажмите кнопку "Пуск" зеленую кнопку, чтобы начать фотоактивации. После завершения удаления массива и промыть очищенную воду, чтобы удалить лишнюю ampliPHY. Открытый образования полимера на некоторых из пятна теперь должна быть доступна.
- Разрешить полимера пятна высохнуть в течение 2 минут, затем распространить две капли ampliRED на массив и позволить окрашивание проводили в течение 2 минут.
- Затем, быстро промыть микрочипов с очищенной водой и насухо протрите тканью.
- Вставьте микрочипов в визуализации бухте ampliPHOX Reader, и нажмите кнопку «New Image Capture" в закладке изображений. После отображаемого, настроить обрезать и сохранить изображение.
- В Анализ вкладки, выберите маску калибровки Чип и кнопку "Auto размещения", чтобы начать анализ. Программное обеспечение будет автоматически производить "Краткий отчет 'показывает количественные результаты. Основываясь на этих результатах, фотоактивации время корректируется на 10 секунд для второго массива калибровки, и процедура повторяется.
- Как только оптимальное время фотоактивации был определен, образец массивы могут быть обработаны с использованием тех же усиление сигнала и изображения протокол, используемый для калибровки массивов.
- После съемки изображения для выборки массивов, маски для вашего конкретного расположения массива, такие как расположение гриппа массива описаны здесь, могут быть created.The ampliVIEW программное обеспечение способно выполнять автоматизированный анализ изображений и генерации гриппа подтипов результаты для каждого образца.
5. Представитель Результаты:
Рисунок 1. Схематическое изображение метода обнаружения ampliPHOX колориметрических. (А) Биотинилированные ДНК цель гибридизации с каждой точки в массиве, и (Б) помечены ampliTAG. (C) ampliPHY раствор затем добавил, и (D) под действием света в форме видимых пятен полимера. (Е) полимера пятна образуются впоследствии окрашиваются нетоксичных красителей для улучшения контрастности.
Рисунок 2. () Грипп низкой плотности расположения микрочипов. Последовательности 1-7 и 10-13 целевым грипп, и последовательностей 8, 9 целевой гриппа B. (В) ampliPHOX и (С) флуоресцентные изображения 2009 гриппа H1N1 («свиной грипп») образца показывает той же схеме обнаружения и методы.
Рисунок 3. Слева направо, представитель изображений ampliPHOX гриппа H3N2, человека происхождения H1N1, 2009 гриппа H1N1 (свиного происхождения), а отрицательные образца. Все три подтипа показать визуально различимых узоров на массив. Обратите внимание на отрицательное, что только MS2 внутреннего контроля видно, что указывает на РТ-ПЦР-амплификации не была запрещена.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Обнаружение ampliPHOX колориметрических технология, представленная здесь, быстрый, недорогой альтернативой один цвет флуоресценции обнаружения для нижних приложений плотность микрочипов. Схематически показано на рисунке 1, принцип обнаружения основан на использовании фотоинициатора этикетке (1Б). В присутствии мономера раствор, содержащий (1С), освещенность причины фотоинициатора (ampliTAG), чтобы вызвать реакцию полимеризации только в маркированных регионов (1D). Хотя продемонстрировал...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Все авторы являются сотрудниками InDevR, Inc, некоммерческая организация. InDevR является коммерциализация технологии ampliPHOX, описанных здесь.
Благодарности
InDevR признает NIH / NIAID U01AI070276 и R43AI077112 для финансирования этой работы.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Реагент / оборудование | Производитель | Каталог # | Комментарии |
| Qiagen MinElute Вирус Спиновые Kit | Qiagen | 57704 | один 60 мкл элюирования |
| QIAcube | Qiagen | 9001292 | необязательный |
| ABI 9800 Быстрый термоциклер | Applied Biosystems | 4441166 | |
| Qiagen OneStep RT-PCR комплект | Qiagen | 210210 | Комплект дНТФ не используется |
| 2x Зрительные буфера | InDevR ООО | MI-5007 | |
| Биотинилированные Mix дНТФ | InDevR ООО | МИ-5009 | |
| Lambda экзонуклеазная | Эпицентр Биотехнологии | LE032K | 2500 U, 10U/μl |
| FluChip грунтовку перемешать | InDevR | N / A | пока не доступны для продажи |
| Орбитальный Шейкер | Madell технологии | ZD-9556- | |
| Вымойте Бункеры | InDevR ООО | MI-4002 | |
| Вымойте стойки | InDevR ООО | MI-4003 | |
| 2x буфера Гибридизация | InDevR ООО | MI-5004 | |
| Калибровка Фишки | InDevR ООО | AP-5006 | |
| Вымойте Буферы н.э. | InDevR ООО | MI-5005 | |
| ampliRED | InDevR ООО | AP-5004 | |
| ampliTAG | InDevR ООО | AP-5001 | |
| 2x ampliTAG буфера | InDevR ООО | AP-5002 | |
| ampliPHY, ampliPHY усилитель | InDevR ООО | AP-5003 |
Ссылки
- Kumar, R. M. The Widely Used Diagnostics "DNA-Microarray"-A Review. Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).
- Miller, M. B., Tang, Y. W. Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology. Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).
- Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. A., Zasedatelev, A. DNA microarrays in the clinic: infectious diseases. BioEssays. 30, 673-682 (2008).
- Call, D. R. Challenges and opportunities for pathogen detection using DNA microarrays. Crit Rev Microbiol. 31, 91-99 (2005).
- Raoult, D., Fournier, P. E., Drancourt, M. What does the future hold for clinical microbiology. Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).
- Dawson, E. D., Rowlen, K. L. MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A. Influenza: Molecular Virology. Wang, Q., Tao, Y. J. , Caister Academic Press. Norfolk, UK. (2010).
- Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray. J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).
- Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. J. FluChip: Experimental evaluation of a diagnostic influenza microarray. J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).
- Wang, Z., Daum, L. T., Vora, G. J., Metzgar, D., Walter, E. A., Canas, L. C., Malanosky, A. P., Lin, B., Stenger, D. A. Identifying influenza viruses with resequencing arrays. Emerg Inf Dis. 12, 638-646 (2006).
- Kessler, N., Ferraris, O., Palmer, K., Marsh, W., Steel, A. Use of the DNA Flow-Thru Chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses. J Clin Microbiol. 42, 2173-2185 (2004).
- Kuck, L. R., Taylor, A. W. Photopolymerization as an innovative detection technique for low-density microarrays. Biotechniques. 45, 179-186 (2008).
- Avens, H. J., Bowman, C. N. Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody arrays. Acta Biomat. 6, 83-89 (2010).
- Sikes, H. D., Jenison, R., Bowman, C. N. Antigen detection using polymerization-based amplification. Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
