Клик-химии основан метод, который позволяет оперативно, неинвазивным и надежный маркировки алкин с метками гликанов в данио эмбрионов описано. Фукозилированных гликанов в обертывающей слой данио эмбрионов в поздней стадии гаструляции были обследованы в этом исследовании.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изображений гликанов в данио рерио Эмбрионы от метаболического Маркировка и Bioorthogonal химии нажмите
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Изображений гликанов в естественных условиях была недавно включена с использованием bioorthogonal стратегии репортер химической обработкой клеток или организмов с азид или алкин с метками моносахаридов 1, 2. Изменение моносахаридов, обрабатывается механизм биосинтеза гликана, включаются в гликоконъюгатов поверхности клетки. Bioorthogonal теги или азид алкин затем позволить ковалентные сопряжения с флуоресцентных зондов для визуализации, или с близостью зонды для обогащения и glycoproteomic анализа. Этот протокол описывает процедуры, как правило, используется для неинвазивной визуализации фукозилированных гликанов в данио эмбрионов, в том числе: 1) микроинъекции одноклеточного эмбриона сцене с ВВП-5-alkynylfucose (ВВП-FucAl), 2) маркировка фукозилированных гликанов в обертывающей слой данио эмбрионов с азид-сопряженных флуорофоров с помощью биосовместимых Cu (I)-катализируемой азид-алкин циклоприсоединения (CuAAC), и 3) изображений с помощью конфокальной микроскопии 3. Метод, описанный здесь, может быть легко распространено на себе другие классы гликанов, например гликанов содержащие сиаловой кислоты 4 и N-ацетилгалактозамина 5, 6, в развивающихся данио и других живых организмов.
Протокол
1. Сбор яиц и Dechorionation
- Сбор и передача данио яиц блюдо Петри 35 мм, удалить столько воды, сколько возможно, а затем добавьте 1 мг / мл Pronease Е в E3 среда эмбриона (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 мМ MgSO 4, рН = 7,4), чтобы переварить хориона.
- Через 3-5 минут, слияние блюдо в стакан заполненный рыбой воды (60 мг "мгновенный океан" на литр дистиллированной H 2 O), и мягко передачи яйца в стакан и дайте яйца "падение" в воду.
- Промыть рыбу яйца с водой в три раза. Большинство яиц, будут освобождены от своих хориона.
- Использование пожарной полированное стекло пипетки Пастера перенести dechorionated яйца агарозном покрытием чашки Петри заполнены E3 среда эмбриона.
2. Микроинъекция с ВВП FucAl
- Подготовка инъекций блюда, следующего за отчетным протокола 7.
- Передача dechorionated яйца в инъекции блюда заполнены E3 среда эмбриона.
- Подготовка иглу, и загрузить с 2 мкл инъекционного раствора. Это решение содержит 20 мМ ВВП FucAl синтезированных chemoenzymatically 8 и либо Alexa Fluor 594-декстрана (5% в / о) в качестве индикатора или фенола красного красителя загрузки (0,1% м / о) в 0,2 М KCl. В качестве отрицательного контроля, заменить ВВП с ВВП FucAl-фукозы в раствор для инъекций.
- Перерыв иглу и отрегулировать давление впрыска и длительности для получения 1 NL падения 9.
- Inject яйца с 1 NL либо решение.
- Передача яйца в агарозном покрытием чашках Петри заполнены E3 среда эмбриона.
- Инкубировать яйца при 28 ° C и удалить неоплодотворенные яйца в течение трех-четырех часов после оплодотворения.
3. BTTES-Cu (I)-катализируемой реакции химии нажмите
- Когда эмбрионы достигают желаемого стадиях развития (например, поздней гаструлы, ткани сегментации и в начале личинка), флаг базе 96-луночного планшета с агарозы.
- Добавить 92 мкл E3 среда эмбриона в каждую лунку с последующим добавлением 4 мкл Alexa Fluor-488 азид (от 2,5 ммоль складе в H 2 O), 2 мкл BTTES-CuSO 4 6:01 комплекса, и встряхните осторожно перемешать.
- Трансфер эмбрионов в колодец содержащих реагент нажмите химии использованием пожарной полированное стекло пипетки Пастера. Каждая скважина должна содержать менее чем за пять эмбрионов.
- Добавить 2,5 мкл свежеприготовленного аскорбат натрия (от 100 мМ складе в H 2 O), чтобы инициировать реакцию нажмите 3. Конечная концентрация каждого реагента: Alexa Fluor-488 азид: 100 мкМ CuSO 4: 50 мкМ; BTTES: 300 мкМ; аскорбат натрия: 2,5 мм.
- Через 3 минуты, добавить 2 мкл bathocuproine сульфонат (50 мМ акций H 2 O), биосовместимые хелат меди, чтобы утолить реакции затем разбавить сразу с 100 мкл среды эмбрион Е3.
- Трансфер эмбрионов на стеклянном блюде Петри и мыть обработанные эмбрионов 2 раза с 15 мл E3 среда эмбриона.
4. Изображений
- Место падения сверхнизкой температуры плавления агарозы (1,2% (м / о) в Е3 среда эмбриона) на нижней Маттек стеклянной посуде микролуночные, и поместить эмбрион в каплю агарозы.
- Позиция эмбрионов сверху или сбоку и поместить блюдо на льду в течение 5 мин, чтобы укрепить падение агарозы. Добавить Е3 среда эмбриона осторожно, чтобы блюдо, пока он охватывает падение агарозы.
- Флуоресценции и яркие изображения области приобрел последовательно использованием конфокальной микроскопии. Все изображения эмбрионов, приобретенный с помощью 5 мкм шагом интервала. Композитный цифры подготовлен с использованием программного обеспечения ImageJ.
5. Представитель Результаты
На рисунке 1 показан рабочий процесс нашего двухступенчатый маркировки стратегии. На рисунке 2 показана маркировка эмбрионов данио рерио через BTTES-опосредованной CuAAC на 9,5 часа после оплодотворения (HPF). BTTES является трис (triazolylmethyl) амин основе лиганда. Это ускоряет CuAAC резко при согласовании с на месте порожденных Cu (I), а также способствует реакции циклоприсоединения быстро в живых системах без видимой токсичности. Сразу же после 3-мин нажмите реакции, мы можем обнаружить надежные маркировки ВВП FucAl лечение эмбрионов (рис. 2, слева панели). Только флуоресценции фона определяется для контроля эмбрионов microinjected с ВВП-фукозы (рис. 2, правой панели).
Рисунок 1. Стратегии маркировки фукозилированных гликанов в обертывающей слой данио эмбрионов.
Рисунок 2. В естественных изображений фукозилированных гликанов во время эмбриогенеза данио через BTTES-Cu (I)-катализируемой химии мыши. Один-клеток эмбрионов данио этапе являются microinjected с разовой дозы ВВП FucAl и позволили развисоч до 9,5 HPF. Эмбрионов затем реагирует с Alexa Fluor 488-азид, катализируемой BTTES-Cu (I). Отреагировали эмбрионов изображаются с помощью конфокальной микроскопии. Максимальная интенсивность г-проектирования изображения Alexa Fluor 488 флуоресценции (верхние панели); Яркий поле (нижний график). Шкала бар: 100 мкм.
Поиск неисправностей
| Проблема | Вызывать | Средство |
| Эмбрионы выглядят нездоровыми | Microinjected решение содержит загрязнений | Чистота нуклеотидных сахара должно быть больше 85%. Проверьте ваш источник. |
| Существует никакой маркировки после реакции | Концентрация меди ниже 30 мкМ | Будьте осторожны, чтобы не разбавлять реакционного раствора, добавляя избыток среда эмбриона E3 при добавлении эмбрионов, так как скорость реакции существенно снижается, когда концентрация меди ниже 30 мкМ. |
| Эмбрионы погибают после реакции | Неправильное обращение с эмбрионами | Убедитесь в том, пипетки является огневой полировкой и реакционного сосуда покрыта очень тонким слоем 0,5% агарозы. |
| Изображения выглядят пятнистым | Реагенты не должным образом смешиваются перед добавлением эмбрионов | Следуйте Рекомендуемый порядок дополнение для реагентов, и убедитесь, что реагенты нажмите химии были должным образом смешиваются перед добавлением эмбрионов. |
| Изображения показывают эмбрионов повреждены | Энергичного встряхивания ущерб эмбрионов в ходе реакции | Осторожно встряхните менее 10 секунд после эмбрионы в раствор. |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Изображений биомолекул В естественных условиях Обеспечивает необходимую понимание их биологической активности в родной среде. В этом видео показано, как маркировка фукозилированных гликанов в обертывающей слой данио эмбрионов осуществляется microinjecting один-клеточной стадии эмбрионы с ВВП FucAl и второй шаг флуорофора сопряжения через BTTES-опосредованной биосовместимых CuAAC 3. Надежная маркировка может быть достигнута в течение 2-3 минут, и помечены гликанов можно обнаружить уже в...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была частично поддержана Национальным институтом здоровья (GM093282 для PW; 3U54AI057158-06S1 с RDS) и ввод в эксплуатацию средств из колледжа Альберта Эйнштейна медицины.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | |
| Медь (II) сульфат пентагидрат | Sigma-Aldrich | 203165 | |
| Alexa Fluor 488 Азид | Invitrogen | A10266 | |
| декстран, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 | |
| (+)-Натрия L-аскорбат | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Bathocuproinedisulfonic кислоты | Acros Organics | 164060010 | |
| Прозрачным дном микролуночные блюдо | Маттек | P35G-1.5-14-C |
Ссылки
- Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).
- Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems. Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).
- Soriano del Amo, D. Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans. J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).
- Chang, P. V. Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).
- Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
- Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J. Vis. Exp. , (2009).
- Wang, W. Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. , (2009).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
