Характеристика Изолированные, вентилируемый и легких мыши Instrumented озарен пульсирующего потока

Краткое содержание

Следующий протокол описывает процесс выделения, вентиляции и инструментальных мыши легких для измерения постоянного или пульсирующего легочного сосудистого давления потока отношения для количественной оценки последствий кровотока, поток воздуха, дыхательных путей изменения и сосудистые изменения на правом постнагрузки левого желудочка.

Аннотация

Изолированные, вентилируемые и подготавливается мыши легких препарата позволяет устойчиво и пульсационного легочного сосудистого давления потока отношения должны быть измерены с независимый контроль над легочной артериальной расход, сигнал расхода, давления в дыхательных путях и давление в левом предсердии. Легочного сосудистого сопротивления рассчитывается на основе многоточечного, постоянное давление потока кривых; легочного сосудистого сопротивления рассчитывается исходя из пульсирующего давления потока кривых, полученных в диапазоне частот. Как теперь признается клинически, импеданс превосходной мерой право постнагрузки желудочков, чем сопротивления, потому что она включает в себя эффекты сосудистых соответствия, которые нельзя не учитывать, особенно в малом круге кровообращения. Три важных показателей импеданса - нулевой Гц Импеданс Z _0, характеристическое сопротивление Z _С, а индекс отражения волны R _W - дать представление о дистального артериального площадь поперечного сечения для потока, проксимальных артериальной жесткости и вверх-вниз по течению сопротивление Несоответствие, соответственно. Все результаты, полученные в изолированных, вентиляцией и перфузией легких не зависят от симпатической нервной системы тонус, объем статуса и последствий наркоза. Мы использовали эту технику, чтобы количественно оценить влияние эмболией легочной артерии и хронической гипоксии на сопротивление и сопротивление, и дифференцировать между сайтами действия (т.е. проксимальные против дистального) вазоактивных веществ и заболеваний с использованием давления зависимость Z _C. Кроме того, когда эти методы используются с легкими генно-инженерного штамма мышей, эффекты на молекулярном уровне дефектов на легочного сосудистого структуры и функции может быть определена.

Протокол

В этом протоколе мы демонстрируем изолированы, вентилируемые, перфузии подготовки легких мышь, которая ранее была использована для количественной оценки влияния эмболией легочной артерии и хронической гипоксии на пульсирующие легочного сосудистого давления потока отношений (Tuchscherer, Вебстер, и Чеслер, 2006; Tuchscherer и др. ., 2007). Короче говоря, мышь легких хирургическим изолирована от окружающих тканей, размещенных в камере нагревается (IL-1; Гарвардского Аппарат, Холлистон, Массачусетс) и вентилируемые (вентиляционная Модуль управления (VCM)-R с таймером счетчик модуль (TCM), Гарвардский Аппарат). Легких сосудистую перфузию с подогревом RPMI 1640, культуре клеток с 3,5% Ficoll использованием шприцевой насос (Cole-Parmer, Вернон Хиллс, штат Иллинойс), чтобы генерировать стабильный поток сигналов или высокочастотных колебательных насоса (бозе-Электро силы, Eden Prairie, MN) параллельно с шприцевой насос для создания пульсирующей легочного сосудистого потока сигналов. Датчики давления (P75, Гарвардский аппарата) мера мгновенного давления в легочной артерии (РАР) и давление в левом предсердии (LAP). Мгновенный расход (Q) измеряется в линию расходомера (Transonic Systems, Inc, Итака, штат Нью-Йорк). Пульсирующего давления потока отношения являются производными от этих измерений, которые обеспечивают понимание легочного сосудистого физиологии и патологии и правой постнагрузки левого желудочка.

1. Оборудование:

1. Изолированные легких настройки, включая мышь вентилятором
2. Данные системы сбора и компьютер с программой LabView
3. Два датчики давления и расходомер для потока перфузат
4. Датчик давления и расходомер (pnemotachometer) для потока дыхательных путей
5. Высокочастотные колебательного насоса и компьютер с программой испытаний Win
6. Стрела / зум микроскоп, лампа
7. Отопление ванна с насосом высокого выхода для ИЛ-1 системы

2. Подготовка ИЛ-1 системы

1. Дистиллированная вода, нагретая до 37 ° С на нагревательной бани распространяется вглубь IL-1.
2. Все насосы, преобразователи и IL-1 канюли подключены через чистые трубы и все трубопроводы промывается дистиллированной водой, нагретой до 37 ° C. Пузырьки воздуха, которые могли бы путешествовать в легкие и вызвать отеки, должны быть удалены. Трубы из колебательного насоса на датчике расхода и от датчика потока в легочную артерию канюли сбрасываются с 1% PBS.
3. P75 датчики давления обнуляется, закрывая клапан канюли, открывая клапан в атмосферу, а затем нажатием кнопки автоматического нуля на усилителе PLUGSYS. Затем клапан в атмосферу закрыт и клапан открыт канюли.
4. Керамических пористых кусок в вентиляции путь ИЛ-1 системы смачивается обеспечить влажность.

3. Решения

1. Подготовка 3,5% по объему Ficoll-RPMI решения и стерильный фильтр СМИ. Фильтрация СМИ гарантирует Есть нет больших частиц, которые могут непреднамеренно эмболизировать легких. Использование стерильных СМИ также снижает вероятность внезапного отека развивается в легких. Наполните одну 10 мл шприц с RPMI для хирургии и один 60 мл шприц с RPMI для каждой экспериментальной суда. Тепло перфузат в 37 ° С водяной бане.
2. Подготовка 1 мл гепарина 500IU/100g веса тела мыши (приблизительно). Гепарин соль 158IU/mg. Для ~ 25 г мыши, смешать 1,25 мг соли гепарина с 1 мл PBS решение в трубочку микроцентрифужных.

4. Вентиляционные мышь

1. После внутрибрюшинного введения 150 мг фенобарбитала в растворе за килограмм в мыши, обеспечивает глубокий наркоз, выполняя жесткие щепотку на лапу. Если нет реакции, подготовить мыши для хирургии, закрепив его передние лапы, чтобы пробковая для стабильности. Примечание: На протяжении всего эксперимента глубина анестезии контролируется внимательно наблюдающий животное. Штифты в лапы и частые разрезы действовать как вредные стимулы, отсутствие реакции на который подтверждает, что животное находится в хирургическом плане анестезии.
2. Спрей груди с 95% алкоголя на влажные вниз мех и использовать прямые щипцы, чтобы захватить кожу на шее. Вырезать 1 см отверстие в коже с помощью прямых ножниц.
3. Как только внутри шеи подвергается, удалить все белое железистой ткани и поверхностные мышцы, глядя на пищевод и трахею. Изолировать пищевода и трахеи из ткани с обеих сторон и сзади.
4. Вставьте небольшой пинцет изогнутый под трахеи и захватить часть шва на другой стороне. Вытяните шва под трахеи и галстук узлом свободные хирурги. Не затягивайте шва или связать себя узами брака.
5. Вырезать небольшой угловой "х" в трахее с небольшими ножницами, не режут весь путь через трахею. Перемещение платы пробки и мышь, чтобы подогревом IL-1. Использование двух тупой пинцет, возьмите трахеи канюли и трахеи ниже "V". Затем сдвиньте трахеи канюли в Траче через "х" открытия. Затяните шва вокруг трахеи и трахеи канюли для обеспечения канюли внутри трахеи. Связать себя узами брака.
6. Начните вентиляции (50% вдохновения, 90 вдохов / мин, при глубоком вдохе) с воздуха в помещении.

5. Перфузии Вентилируемые мышь

5.1. Доступ правого желудочка для введения гепарина

1. Спрей мыши груди с алкоголем снова для мокрой шерсти. Удалите все кожа на груди выше ребра использованием прямых щипцов и прямыми ножницами. Вырезать вверх вдоль грудины. Поднимите кожи с каждой стороны, а затем разрезал кожу следующие линии нижних ребер.
2. Возьмитесь мечевидного отростка в нижней части грудины с помощью пинцета и вырезать отверстие в диафрагме использованием прямых ножниц. Захватите диафрагмы с помощью пинцета и разрезать его от ребра.
3. Возьмитесь мечевидного отростка снова с помощью пинцета (левая рука) и использовать шаровой наконечник, угловые ножницы, чтобы разрезать грудину и через ребра, соблюдая осторожность, чтобы не порезать легких, сердца или кровеносных сосудов (использование шаровой наконечник на ножницы для вас). Там будет кровь, но до тех пор, как передний край из ножниц от грудины, сердце и легкие не будут сокращены.
4. Возьмитесь ребер на левой стороне и срезать как можно больше ребра по мере необходимости подвергать сердце. Медленно вводить правого желудочка с 0,1 мл гепарина решение. Этот шаг важен для предотвращения образования тромбов в легких, которые повреждают эндотелиальные клетки и ухудшают перфузию. Гепарин должен быть введен в то время как сердце еще билось.

5.2. Иглу основной легочной артерии

1. Срежьте остальные ребра (левая и правая сторона) с использованием назад (округленно) конец пинцетом осторожно надавите легкие от ребра стены. Схватив легкие сами повреждения нежной ткани. Случайный контакт между ножницами советы и легочной ткани также причинить ущерб.
2. Перемещение микроскоп на место через легкие. Срежьте железистой и жировой ткани в верхней части сердца. Используйте пинцет, чтобы вытащить его из артерий и вен, а затем разрезать ножницами весной в то время как ткани при растяжении.
3. Использование другого тупой набор пинцетов, совок справа налево, сверху сердца под левого предсердия / желудочка, чтобы получить кончике пинцета под аорты и легочной артерии (ПА). Делайте это осторожно, не должно быть сопротивление пинцетом. Использование тупой пинцет снижает вероятность случайного прокола легочной артерии или аорты.
4. Как только пинцет наконечник под аорты и ПА, возьмите кусок шва и тянуть до конца. Галстук свободно узел хирургов. Не затягивайте шва или связать себя узами брака.
5. Дополнительно: использовать угловые ножницы для удаления нижней половины тела. Сократите через ребра и позвоночник; резки аорты и полой вены вызовет значительное количество крови течь - использование Q-Tip, чтобы остановить поток. Место в мешок для мусора.
6. Премьер ПА канюли с 4 мл из 10 мл шприца RPMI. Дважды проверьте, что все трубопроводы не содержит пузырьков воздуха. Перфузии легких дистиллированной воды или пузырьков может привести к отекам.
7. Отрежьте небольшую выемку правого желудочка свободной стене и вставить ПА канюли, стремясь вниз и вправо. Кончик канюли должны быть видны через прозрачную стену ПА. Настаивать небольшое количество RPMI для подтверждения Вашего местоположения. Затяните шва вокруг канюли, аорты и ПА и связать узлом. Обратите внимание, что на данный момент, аорты также связана с таким фактическим перфузии не следует начинать до левого предсердия является канюлю.

5.3. Иглу в левое предсердие

1. Вырезать выемкой в ​​нижней части левого желудочка и инертных левого предсердия (LA) канюли, направленный вверх. Незначительное давление может быть, необходимых для открытия митрального клапана в этом направлении. В нужном месте, кончик канюли будет проскочить и быть безопасным, без шва.

5.4. Начало перфузии

1. Вручную влить RPMI с 10 мл шприц на 0,3 мл в минуту до RMPI проявляется в отток трубки (розово-иш цвета в отличие от ясно PBS). Если нет потока в отток труб, повторно позицию Л. канюли. Если нет оттока может быть получена с повторного позиционирования, проверьте наличие утечек в системе легочной артерии. Утечка или разрыв в легочной артерии не могут быть устранены, это является поводом для прерывания эксперимента.
2. Подключите 60 мл шприц, чтобы ПА канюли через IL-1 систему и начать 1ml/min вливание перфузат, проверка на утечку и убедившись, легкие становятся белыми, которая показывает, что RPMI заменяет кровь в легкие. Заливать с медленным потоком в течение двух минут.

6. Измерение пульсирующего и устойчивое давление в легочной-Flow Отношения

1. Для пульсирующего потока исследований, первый набор колебательных перемещений поршня насосажелаемых уровней для каждой частоты в WinTest программу, основанную на предыдущих экспериментов. Благодаря изменчивости в структуре легких и механики, перемещений, должны быть скорректированы для каждой мыши. Установить постоянный поток до нужного уровня. Откройте клапан, чтобы колебательный насос и начать записывать данные прямо перед запуском колебательные профиля потока (Wintest программы). Откройте файл данных и график экспериментальных потока (Q) в Excel. Отрегулируйте колебательных перемещений поршня насоса на каждой частоте (Wintest программы), так что Q макс и мин Q являются по своему желанию.
2. Для устойчивого потока испытаний, закройте кран на колебательные насоса. Если этот клапан остается открытым, колебательные насос действует как конденсатор, увлажнения изменяется от одного расхода в другую. Сбор данных, по крайней мере 10 секунд на каждую скорость потока или до давления ПА не изменяется более чем на 5%.
3. Для любой пульсирующей или постоянного измерения расхода, старые вентиляции при постоянном давлении до сбора данных. Резюме вентиляции сразу же после сбора данных.
4. Следите за RPMI в дыхательных путях трубы; это свидетельствует о отеки и является поводом для прерывания эксперимента. Кроме того, не позволяйте RPMI достичь давления в дыхательных путях или датчиков потока, поскольку он может повредить датчики.

7. Представитель Результаты:

Представитель устойчивые результаты:

В изолированных легких настройки экспериментатор имеет возможность самостоятельно контролировать не только легочная поток Q, но и давление в дыхательных путях P _воздух и левого предсердия LAP давления. Это выгодно, так как Q, P _воздух и LAP влияние легочной сосудистой и легочной результате PAP давление артерии. Еще одним преимуществом является то, что полученные результаты зависят от симпатической нервной системы ¹ тон, объем статус, и анестезия ^2.

PAP изменения, вызванные ступенчатый изменения в Q при фиксированном р _{воздуха} и фиксированный или различной LAP показаны на рисунке 1. Отметим, что в изолированном препарате легких, LAP канюли, как правило, связаны с трубкой, которая направляет перфузат в контейнер для отходов. С этой трубы на месте, LAP линейно зависит от Q-за течения Пуазейля. Тем не менее, высота розетки и контейнер для отходов может быть скорректирована вручную, чтобы обеспечить постоянный, ненулевое LAP или трубки могут быть удалены, чтобы нулевой LAP, что не зависит от Q.

Представитель пульсирующего Результаты:

Хотя произвольный пульсирующий поток сигналов могут быть получены с этой системой, мы обычно генерируют поток форма Q = 3 + 2 греха (2 е πt) мл / мин на частотах F = 1, 2, 5, 10, 15 и 20 Гц для оценки линеаризованной сопротивление легочной сосудистой (рис. 2: верхняя часть). Из полученной PAP, LAP и Q измерений, легочного сосудистого сопротивления величины (Z) и фазу (θ) вычисляются по первому разложения одного полного синусоидального цикла DP = PAP-LAP и Q на каждом введенных синусоидальной частоты скорость потока в серию синусоидальных гармоник использованием преобразования Фурье. Отношение давления превращаются в поток преобразования дает легочного сопротивления vascualar, PvZ = FFT (DP) / FFT (Q), которая имеет величину Z и фазы θ. Входной импеданс Z _0, характеристическое сопротивление Z _С, а индекс отражения волны R _W, рассчитываются исходя из величины сопротивления. В частности, Z ₀ вычисляется из Z на 0-й гармоники (F = 0 Гц), усредненная по всем частотам, Z _C рассчитывается как среднее между Z первого минимума (5 Гц) и 20 Гц, а R _W рассчитывается как (Z _{0-Z C)} / (Z + Z _{0 C)} ^3.

Рисунок 1 Устойчивый поток сигналов (верхний ряд) и в результате давления. (Во втором ряду: PAP, P _{воздух,} LAP) как функцию времени с различными комбинациями LAP и Р _{воздухе.} Нижний ряд показывает, PAP против Q. В (А) и (Б), LAP увеличивается и уменьшается с Q, поскольку отток трубки была на месте. Это трубка была снята для (С), так что LAP постоянна и не зависит от Q. В (D) и (Е) высотой выходе трубы была скорректирована вручную, чтобы LAP выше, но не зависит от Q. P _{воздухе} либо в конечного вдоха (A, C, D) или в конце выдоха (В, Е) давления.

Рисунок 2 пульсирующего потока сигнала Q (верхняя панель) и в результате давления (нижняя панель: PAP, LAP и P _{воздух).} Как функция времени. Из этих пульсирующего давления в легочной потока отношений, PvZ может быть рассчитана, которая отражает общее право постнагрузки левого желудочка.

Обсуждение

Критические шаги в хирургии

Очень важно, чтобы внимание уделяется при резке грудную клетку от легких. Легкие должны быть отремонтированы и не стесняясь окружающих тканей во время инфляции, но не были повреждены в процессе изоляции. Использование плоского объекта, как задняя часть щипцов может быть использован для хранения легких от стенки грудной клетки так, чтобы было ясно путь ножницы, чтобы вырезать. Другим важным шагом является размещение шва вокруг легочной артерии и аорты. Использование п...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Шприц 1 мл	Fisher Scientific	14-829-10F
10 мл шприц	Fisher Scientific	14-823-2A
60 мл шприц	Fisher Scientific	13-689-8
RPMI с GLN 6/PK	Fisher Scientific	MT10040CV
Бутылочные фильтры	Fisher Scientific	09-761-57
Ficoll PM 70	Sigma-Aldrich	F2878-100G
Гепарин	Sigma-Aldrich
Y27632	Sigma-Aldrich	Y0503
Угловой шар Ирис ножницы	Fine Science Tools	14109-09
Vannas Spring Scissors - 4 мм лезвия	Fine Science Tools	15018-10
Fine Iris Ножницы - прямые	Fine Science Tools	14106-09
Dumont #5/45 Щипцы	Fine Science Tools	11251-35
Dumont Medical Biology Щипцы	Fine Science Tools	11254-20
Lauda E100 ECO-line 003	VWR international	Сравнимо с Lauda-Brinkmann E-103, 62400-922
IL-1 Изолированная перфузионная система легких мыши	Harvard Apparatus	739904
Преобразователь артериального давления P75 для модуля PLUGSYS	Гарвардский аппарат	730020
TS410 Модули расхода	Transonic	TS410
ME 4 PXN Прецизионные PXN Встроенные датчики расхода	Transonic	ME 4 PXN
Cole-Parmer Многошприцевые насосы	Cole-Parmer	EW-74900-20
Нембутал 50 мг/мл 20 мл Флакон	Amatheon