Методическая статья

Поляризованные транслокации флуоресцентных белков в Xenopus Эктодермы в ответ на Wnt сигнализации

10.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2700

⸱

26 мая 2011 г.

 , 
1Department of Developmental and Regenerative Biology, Mount Sinai School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Xenopus эмбриональной эктодермы стала привлекательной моделью для исследования клеточной полярности. Анализа описывается, в котором субклеточных распределение флуоресцентных белков оценивается в эктодермы клеток. Этот протокол поможет решить вопросы, связанные с пространственным управления сигнализацией.

Аннотация

Сотовые полярность фундаментальное свойство клеток эукариот, который динамически регулируется как внутренних и внешних факторов во время эмбрионального развития 1, 2. Один из сигнальных путей, участвующих в этом регулирование Wnt путь, который используется во много раз во время эмбриогенеза и критические для человека болезнь 3, 4, 5. Множественные молекулярные компоненты этого пути согласованно регулировать сигнализации в пространственно-ограниченной форме, но основные механизмы, полностью не поняты. Xenopus эмбриональных эпителиальных клеток является отличной системой для изучения субклеточных локализации различных сигнальных белков. Флуоресцентные белки слияния выражены у эмбрионов Xenopus путем микроинъекции РНК, эктодермального эксплантов готовятся и локализации белка оценивается epifluorescence. В этом протоколе исследования мы описываем, как субклеточные локализации Diversin, цитоплазматических белков, которые были причастны к сигнализации и клеточной полярности определения 6, 7 визуализируется в Xenopus эктодермальных клеток для изучения передачи сигналов Wnt 8. Коэкспрессия Wnt лиганда или Frizzled рецепторов изменяет распределение Diversin сливается с красного флуоресцентного белка, ППП, и новобранцы его клеточную мембрану в поляризованной моды 8, 9. Это бывший протокол естественных условиях должно быть полезным дополнением к лабораторные исследования в культивируемых клетках млекопитающих, в котором пространственные контроль сигнализации отличается от неповрежденной ткани и является гораздо более трудной для анализа.

Протокол

1. Экстракорпоральное оплодотворение яйца из Xenopus

  1. Получить яйца самка лягушки, которые вводили хорионический гонадотропин человека (400 ед / лягушка) 12 часов до эксперимента.
  2. Место яйца в небольшом количестве (0,5-1 мл) на 1 изменение х Марка раствор Рингера (MMR) 10 к яйцам и оплодотворяют их в пробирке с небольшой фрагмент расчлененного яичка. Через 2-3 мин, добавить 0,1 х MMR, чтобы покрыть всю поверхность яйца. Через 20 минут, яйца желе слой удаляется на 3% цистеина - HCL (доводят до рН 8 с гидроксидом натрия). Яйца моют с 0,1 х MMR в три раза и оставили в холодном инкубатор (13 ° С) для инъекций.
  3. Оплодотворенные яйца позволили разработать до 2-4 клеточной стадии. Для инъекций, эмбрионы переносят в раствор, содержащий 3% Ficoll, 0,5 х MMR.

2. РНК Микроинъекция

  1. РНК синтезируются из линеаризованной ДНК с использованием шаблонов mMessage mMachine комплект (Амбион) и разбавляют РНКазы свободной воды на фондовом концентрации 0,1-1 мкг / мкл. Оптимальные дозы РНК для инъекций определяются в пилотных экспериментах. РНК для Diversin-RFP, мембранные маркера GFP-CAAX и Frizzled 8 используются в 0,1-1 нг на инъекцию.
  2. Инъекция иглы готовы с иглой съемник из капилляра, а затем с помощью иглы мясорубки. Перед инъекцией, каждая игла откалиброван с водой, чтобы извлечь 10 п жидкого на инъекцию.
  3. Для инъекций, эмбрионы помещаются в пластиковый блюдо в большую каплю 3% Ficoll, 0,5 х MMR. Один микролитр решение РНК всасывается в инъекционной иглой с Narishige microinjector. 10 п РНК вводят животным бластомеров от 8 клетка эмбриона 2-3 раза. Вводят эмбрионы переносятся в скважине 12-луночного планшета.

3. Подготовка эктодермальная эксплантов

  1. Когда вводят эмбрионы достигают ранней стадии гаструлы, они переводятся в 0,6 х MMR решение в 3 см пластиковая тарелка с покрытием 1% агарозы. Желточный мембрана удалены вручную с парой щипцов. Эктодермальная эксплантов которые вырезали из эмбрионов с помощью иглы вольфрама и hairloop.
  2. Эктодермальная эксплантов переносятся в стеклянный пузырек и фиксировали 3,7% формальдегида в фосфатном буферном растворе (PBS) в течение 30 минут. Исправлена ​​эксплантов промывают PBS в три раза (10 минут каждый). DAPI входит в третью мыть для окрашивания ядер.
  3. Эксплантов установлены на предметное стекло. Две полосы скотчем прикреплены к слайд-шоу и эксплантов помещаются между двух полос. С наружной поверхности эксплантатов это пигментированные, внутренняя сторона должна быть обращена эксплантов объектива микроскопа. Добавить два-три 20 мкл капли решение для монтажа (70% глицерина в PBS в том числе 25 мг / мл DABCO, анти-выцветания реагента) 11. Положите покровное на вершине.

4. Изображений эксплантов Под Флуоресцентный микроскоп

  1. Образцы смотреть под Zeiss Axioplan флуоресцентный микроскоп с соответствующими фильтрами.
  2. Изображения взяты с Apotome привязанность к себе конкретный самолет из нескольких независимых эксплантов.

5. Cryosectioning

Cryosectioning это альтернативный способ визуализировать распределение флуоресцентных белков в клетке и больше подходит для иммунной окраски. На этапе 10, эмбрионы фиксированной в течение 1-2 часов с фиксатором Дента (20% ДМСО, 80% метанола), промывали PBS, и встроенных в 15% рыбы gelatin/15% раствором сахарозы 11. Встроенный эмбрионы быстро замороженных в сухом льду и cryosections генерируются на Leica криостат. Сечения будет включать эктодермального клетки, которые наследуют вводили РНК и их перевод белковых продуктов. Разделы сохраняют флуоресценции и может быть immunostained со специфическими антителами, а затем помечены вторичных антител, конъюгированных с флуоресценции. Ядра окрашивали DAPI. Монтаж средств массовой информации такие же, как описано выше. Изображений может быть выполнена как описано выше.

6. Представитель Результаты:

Рисунок 1
Рисунок 1. Frizzled рецепторов новобранцев Diversin к клеточной мембране. Эктодермы клеток, экспрессирующих Frizzled 8 (Xfz8) и Div-RFP РНК выявить Div-RFP на клеточную мембрану, а не центросомы (как показал г-тубулина совместного окрашивания). Схема эксперимента находится на самом верху; типичный сечение показано на рисунке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы использовали выше протокол, чтобы охарактеризовать субклеточные локализации Diversin. В эксплантатах животных полюса, Diversin-ППП был обнаружен рядом с ядром и colocalized с г-тубулина, centrosomal маркер, в cryosections (рис. 1). После субклеточные локализации белка определяется, удаление конструкции могут быть сгенерированы установить, какие белковых доменов являются необходимыми и достаточными для субклеточные локализации. Используя этот подход, centrosomal области локализации Diversin будут переведены в середине...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Исследования в лаборатории Сокол спонсируется Национальным Institues здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Ссылки

  1. Gurdon, J. B. Embryonic induction --- molecular aspects. Development. 99, 285-306 (1987).
  2. Principles of Developmental Genetics. Moody, S. A. , Academic Press. (2007).
  3. Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127, 469-480 (2006).
  4. Klaus, A., Birchmeier, W. Wnt signalling and its impact on development and cancer. Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).
  5. Gordon, M. D., Nusse, R. Wnt signaling: multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors. J Biol Chem. 281, 22429-22433 (2006).
  6. Schwarz-Romond, T., Asbrand, C., Bakkers, J., Kuhl, M., Schaeffer, H. J., Huelsken, J., Behrens, J., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. The ankyrin repeat protein Diversin recruits Casein kinase Iepsilon to the beta-catenin degradation complex and acts in both canonical Wnt and Wnt/JNK signaling. Genes Dev. 16, 2073-2084 (2002).
  7. Moeller, H., Jenny, A., Schaeffer, H. J., Schwarz-Romond, T., Mlodzik, M., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. Diversin regulates heart formation and gastrulation movements in development. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 15900-15905 (2006).
  8. Itoh, K., Jenny, A., Mlodzik, M., Sokol, S. Y. Centrosomal localization of Diversin and its relevance to Wnt signaling. J. Cell Sci. 122, 3791-3798 (2009).
  9. Itoh, K., Jacob, J., Sokol, Y. S. A role for Xenopus Frizzled 8 in dorsal development. Mech Dev. 74, 145-157 (1998).
  10. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30, 675-686 (1982).
  11. Itoh, K., Brott, B. K., Bae, G. U., Ratcliffe, M. J., Sokol, S. Y. Nuclear localization is required for Dishevelled function in Wnt/beta-catenin signaling. J Biol. 4, 3-3 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи