Live-ячейки изображения сенсорных клеток-предшественников органов в интактных Drosophila Куколки

Краткое содержание

В этом видео мы опишем метод для живого изображения ячейки асимметричного деления органа чувств и клетки-предшественники клеток эпидермиса в неповрежденных Drosophila Куколки

Аннотация

С момента открытия зеленый флуоресцентный белок (GFP), произошло революционное изменение в использовании живого-клеточной визуализации как инструмент для понимания фундаментальных биологических механизмов. Поразительные успехи были особенно очевидны в дрозофилы, чей обширный инструментарий мутантов и трансгенных линий обеспечивает удобную модель для изучения эволюционно-сохраняется развития и клеточных биологических механизмов. Мы заинтересованы в понимании механизмов, контролирующих клеточное судьба спецификации взрослых периферической нервной системы (ПНС) у дрозофилы. Щетина, которые покрывают головы, грудной клетки, живота, ног и крыльев взрослой мухи отдельных mechanosensory органов, и были изучены в качестве модельной системы для понимания механизмов Notch-зависимых решений ячейки судьбы. Сенсорные органы предшественника (СОП) клетки microchaetes (или небольшая щетина), распределены по всему эпителия куколки грудной клетки, и задаются в течение первых 12 часов после начала pupariation. После уточнения, SOP клетки начинают делиться, разделения определитель ячейки судьба Numb одной дочерней клетки во время митоза. Numb функции клеточных автономных ингибитор сигнального пути Notch.

Здесь мы покажем способ следовать динамики белков в СОП клетки и ее потомства в течение нетронутыми куколки грудной клетки, используя комбинацию тканеспецифические Gal4 водителей и GFP-меткой слитые белки ^1,2. Этот метод имеет преимущество перед фиксированным ткани или культивированный эксплантов, поскольку он позволяет проследить все развитие органов у спецификация нейронных предшественником роста и терминальной дифференцировки органа. Поэтому мы можем прямо коррелируют изменения в поведение клеток к изменениям в терминальной дифференцировки. Более того, мы можем объединить жить метод визуализации с мозаичными анализа с репрессируемый маркер ячейки (MARCM) систему оценки динамики меченых белков митотического СОП под мутанта или дикого типа условий. Используя эту технику, мы и другие показали, роман взглянуть на регулирование асимметричной деление клеток и контроль Нотч сигнализации активации в СОП клеток (примеры включают в себя ссылки ^{1-6,7, 8).}

Протокол

Необходимые материалы: Вскрытие стерео-микроскопа, Двусторонняя лента, стандартный слайд микроскопа и покровное, рассечение щипцы (размер 5 или 5,5), мягкой зубной щеткой, силиконовые вакуумные смазки, 5cc шприц, ватман, конфокальная или epifluorescence микроскоп с цифровой камерой и изображение приобретение программного обеспечения.

1. Куколки Dissection

1. Настройка крест (с использованием подходящей комбинации Gal4 линии и GFP меткой гибридный белок под контролем UAS) или места мух от фондового вы хотите изображение в несколько свежих флаконах при 25 ° C.
2. SOP клетки обычно начинают размножаться на куколки грудной клетки в восемнадцать часов после начала pupariation, поэтому мы выбрать "белого" куколки из соответствующих фондовых летать или крест. Белый куколок куколки морфологии, но непигментированных куколки случае, указывая, что pupariated, которые в течение часа.
3. Подождите около 18 часов.
4. Поместите кусок двухсторонней ленты на слайде. Сбор куколок и придерживаться куколки случае двухсторонней ленты с вентральной стороной вниз. Возьмитесь за край жаберной крышки (круговой люк на передней спинной кончик куколки случае) с пинцетом
5. Аккуратно поднимите, удалять и отбрасывать крышечки, открывая глава незрелых летать.
6. Используйте пинцет, чтобы начать разрыв вдоль стороны куколки случае. Поднимите средней части куколки случае из разорванной сторону и привести его к противоположной стороне, либо удалить его полностью или прикрепить его на ленту, открывая грудной клетки и передней части брюшной полости. ( Обратите внимание: Существует разрыв между развивающимися летать и куколки случае. Будьте осторожны, чтобы не проколоть летят, как стена случае разрывается.)
7. Начало резки по той же стороне куколки случае к заднему концу. Еще раз, будьте осторожны, чтобы не проколоть летать. Вытяните куколки случае противоположной стороне летать и нажмите на него на двухсторонней ленты. Живот должен теперь быть полностью открыты. Место мягкой зубной щеткой прямо под главой летать. Как только муха прилипла к кисти и без куколки случае используйте кисть осторожно поднимите летать за пределы слайда.

2. Монтаж куколки

После вскрытия, куколки затем монтируется между горкой и покровное:

8. Изолированные куколки удалены от случая может быть помещена в центре спинной стороны предметное стекло вверх.
9. Сделать квадратной рамке из ватмана 18X18mm оставляя 10х10 мм отверстие в середине. Погрузите бумаги в воду, пока насыщенным. Место вокруг куколок.
10. Использование 5 мл шприц с силиконовой смазкой вакуум, нанесите ровным слоем жира вокруг рамки ватмана. Смазка слой должен вписываться в покровное (рис. 1) и толщина должна быть только чуть больше, чем куколки диаметре.
11. Поместите каплю воды (1 мкл) в центре 22x22 мм и покровного место покровное на над подготовкой таких, что небольшие капли воды контактов поверхности, которую вы хотите изображения, notum в данном случае). Сжатие осторожно, чтобы сформировать полный уплотнение жира вакуумом и плоская поверхность контакта между покровным и куколки кутикулы.
12. Подготовка могут быть отображены на перевернутом или прямом microcopes, используя либо epifluorecence, конфокальной (лазерное сканирование или вращающийся диск типа) или двухфотонного конфокальной. Если вы осторожны, взрослых мух может быть восстановлено через несколько дней.

3. Представитель Результаты:

Использование SOP конкретных Gal4 линии ( Neuralized-Gal4) подошел к GFP меткой белков для обозначения митотического веретена (тубулина или Тау-GFP) или гистоновых белков (H2B-GFP), можно наблюдать разделение плоскости деления клеток SOP, продолжительность клеточного цикла, или количество митотических подразделений с помощью промежуток времени изображений ⁹. Другие слитых белков, предназначенных для клеточных органелл, таких как Раб-ГТФаз, чтобы отметить различные endocytic купе (Rab5-GFP для ранних эндосом или Rab11 GFP для переработки эндосомы) или белков важны в Нотч сигнализации регулирования (Numb-, партнер Numb-GFP, или Sanpodo -GFP), может дать важную информацию о механизмах асимметричной деление клеток и торговли мембранного белка ^2,3,7,10,11.

Рисунок 1: куколки рассечение и монтаж. А. Шаг за шагом изображения показывают процедуру для удаления куколки дела и подготовиться нетронутыми куколки для монтажа и живой клетки изображений. Куколки удаляются из флакона и помещен, спинной стороной вверх, на двойной ленты палки придает стеклу. Первая колонка, удаления крышечки и разрыв вдоль стороны куколки случае. Вторая колонка, удаления куколки случае из грудной и брюшной полости. Свободная куколка, затем поднял из куколки случае с помощью мягкой зубной щеткой. В. Монтаж куколки между горкой и покровное. Куколка находится спинной стороной вверх на стекле, окруженные смоченной рамках ватмане. Непрерывный шарик силиконовый вакуумной смазки выдавливается из 5cc функции шприц для уплотнения слайд-покровное комбинации, защищая от высыхания куколки и подъемные покровное так оно покоится мягко куколки грудной клетки. Маленькая капля воды (1 мкл) на границе между покровным и грудной клетки кутикулы улучшает качество изображения при использовании значительно погружения целей (вода или масло). Щелкните здесь для просмотра больших изображений.

Рисунок 2: Представитель изображений живых клеток СОП и дифференцированных внешних органов чувств, сделанные с использованием наших куколки рассечение и монтажные процедуры.. Изображения, извлеченные из временных рядов ячейки SOP митотической выражения актин-гибридный белок GFP под контролем Neuralized- Gal4 ( Neur- Gal4/UAS-actin-GFP) заметим, корковые накоплением актина при расщеплении борозды (1 изображение / каждые 2 минуты). B. Клетки SOP дочь совместного выражения Партнером Numb-RFP (красный) и Rab5-GFP обусловлен Neuralized- Gal4, обратите внимание на асимметричное распределение Pon-ППП в одной дочерней клетки (pIIb) и распределение ранних эндосом в обеих дочерних клеток. C. Том оказание Z-серии приняты дифференцированных внешних органов чувств на поздней стадии куколки. Кутикулы структур, таких как mechnosensory щетины и эпидермиса волос выявленных кутикулы аутофлюоресценция (красный). Кроме того, мы использовали MARCM системы, чтобы выразить Lgl-GFP (направляемый Neuralized- Gal4) в подмножество органа чувств клеток-предшественников (зеленый). (Эти изображения были получены с помощью Nikon C1 сканирующей конфокальной микроскопии использованием 60X 1,45 NA цель)

Обсуждение

В этом видео мы проиллюстрируем технику для изоляции и монтажа Drosophila Pupaefor жить визуализации ячейки SOP клеток на куколки notum. Удаление куколок из куколки случае требуется твердая рука, соответствующие инструменты, и некоторые практики, но проста в освоении. Важно, что постановка куколки быть сделано точно, с тем чтобы обеспечить относительную легкость вскрытия и ловить распространения фазы SOP развития. Как только установлен, куколки будут и впредь развиваться между горкой и покровное, и в большинстве случаев, достигнет pharate этапе взрослой, и в конечном итоге eclose. По нашему опыту, ячейка может быть отображены в течение нескольких часов. Этот метод установки не ограничивается наблюдением ПНС клеток-предшественников в куколки грудной клетки, но может быть использован для визуализации любой клетки, которые близки к поверхности кутикулы и доступными для объектива микроскопа, (обратите внимание, что наблюдения проводятся на этапе, когда куколки случае можно удалить, не убивая куколки, как правило, от 10 до 14 ч после образования пупария). Мы успешно визуализируются соединительных белков, белков цитоскелета и регуляторы пузырьков торговли куколки эпителиальных клеток (неопубликованные данные).

Куколки монтажа техники также позволило нам разработать метод изображения кутикулярных структур в конце куколки этапе с помощью сканирующей конфокальной микроскопии, для того, чтобы визуализировать морфологию mechanosensory щетинки и волоски эпидермиса использованием внутренней аутофлюоресценция от кутикулы. Эти изображения напоминают сканирующей электронной микрофотографии летать кутикулы, но могут быть получены от животных, и позволяют одновременно визуализировать кутикулярной морфологии и экспрессии GFP флуоресценции ^6,7,12.

Материалы

• Шотландский двойной ленты палки
• Стекло
• 18mmX18mm покровное
• Щипцы
• Ватман
• Dow Corning Силиконовые вакуумной смазки
• 5 мл шприц
• Pipetter
• Конфокальной микроскопии или epifluorescence