Процедура жидкой основе культивирования и отпуск С. Элеганс Штаммов выражения флуоресцентных белков репортер рассказал, что не требует дорогостоящего оборудования сортировки. Этот подход может быть применен к многочисленным индуцибельной С. Элеганс Генов для обнаружения наркотиков или биодатчиков загрязняющих веществ.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Высокопроизводительный скрининг и биодатчиков с люминесцентными С. Элеганс Штаммы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Высокопроизводительный скрининг (HTS) представляет собой эффективный подход к поиску химических модуляторов биологических процессов. Однако многие соединения, выявленные в ходе скрининга с использованием моделей на клеточных культурах, часто оказываются токсичными или фармакологически неактивными in vivo1-2. Скрининг на моделях целых животных позволяет избежать этих проблем и оптимизировать процесс разработки лекарственных препаратов.
C. elegans — это многоклеточный модельный организм, который хорошо подходит для HTS. Он имеет малый размер (<1 mm), что позволяет экономично выращивать и дозировать его в жидких средах. C. elegans также является одной из наиболее удобных в экспериментальном плане животных моделей, позволяющих быстро и детально определить механизм действия препарата3.
Мы описываем протокол культивирования и распределения флуоресцентных штаммов C. elegans для высокопроизводительного скрининга химических библиотек или обнаружения загрязнителей окружающей среды, которые изменяют экспрессию специфического гена. Большое количество синхронизированных по развитию червей выращивают в жидкой культуре, собирают, промывают и суспендируют до заданной плотности. Затем червей переносят в черные плотнодонные 384-луночные планшеты с помощью перистальтического дозатора жидкостей. В лунки с червями могут быть добавлены малые молекулы из химической библиотеки или тестовые образцы (например, вода, пища или почва). Интенсивность флуоресценции в режиме реального времени измеряют in vivo с помощью флуоресцентного планшетного ридера. Этот метод может быть адаптирован для любого индуцибельного гена C. elegans, для которого доступен подходящий репортер. Многие индуцибельные транскрипционные пути стресса и развития хорошо определены у C. elegans, и для многих из них уже существуют трансгенные репортерные штаммы с GFP4. В сочетании с соответствующими трансгенными репортерами наш метод может быть использован для скрининга модуляторов путей или для разработки надежных биосенсорных анализов для обнаружения загрязнителей окружающей среды.
Мы демонстрируем наш протокол культивирования и дозирования C. elegans на примере разработанного нами метода высокопроизводительного скрининга (HTS) для мониторинга фактора транскрипции SKN-1 («cap ‘n’ collar») у C. elegans. SKN-1 и его млекопитающий гомолог Nrf2 активируют цитопротекторные гены при окислительном и ксенобиотическом стрессе5-10. Nrf2 защищает млекопитающих от многочисленных возрастных заболеваний, таких как рак, нейродегенерация и хроническое воспаление, и стал важной мишенью для химиотерапии11-13. Наш метод основан на использовании трансгенного GFP-репортера для мишени SKN-1 — гена gst-414, который кодирует глутатион-S-трансферазу6. Репортер gst-4 также служит биосенсором ксенобиотиков и окислителей, активирующих SKN-1, и может быть использован для обнаружения низких уровней таких загрязнителей, как акриламид и метилртуть15-16.
Протокол
1. Подготовка бактериальных пищевых червь
День 1
- Добавьте 5 мл насыщенного Е. OP50 кишечной бактериальной культуры до 500 мл бульона Потрясающе дополнена с 50 мкг / мл стрептомицина и расти в инкубатор встряхивания (225 оборотов в минуту) в течение ночи при температуре 37 ° C.
День 2
- Сплит ночь бактериальной культуры в десятку 50 мл пробирки центрифуги и бактерий в охлажденном центрифуге при 2500 RCF течение 20 минут.
- Декантировать от LB бульоне и ресуспендируют каждую бактериальную гранул в 10 мл жидкой питательной среды нематоды (НГО). Встряхните ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы представляем метод выращивания и приготовления большого количества трансгенных нематод. Оборудования, используемых для культивирования червей является стандартным для лабораторий, осуществляющих молекулярное клонирование и наливных и флуоресценции оборудования является стандартной для лабораторий обработку большого количества микропланшетов. Другие методы выдачи большого количества живых C. Элеганс требуют дорогостоящего частиц сортировочного оборудования 19. Pgst-4:: GFP анализа могут бы.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
C. Элеганс трансгены были предоставлены Caenorhabditis генетический центр (Университет Миннесоты, Миннеаполис, Миннесота). Эта работа была поддержана NIH грант R21 NS0667678-01 для KS. Все авторы участвовали в сборе, анализе и интерпретации данных. CKL, KS, и КЗК участие в написании и пересмотра рукописи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии (необязательно) |
| LB бульоне | Исследования Продукты интернэшнл корп | L24066 | |
| Потрясающе бульон | Исследования Продукты интернэшнл корп | T15100 | |
| Synergy ™ HT Multi-режим Считыватель микропланшетов | Биотек | Фильтры: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Выберите диспенсер | Биотек | ||
| Worm дозирования колбу | Южный научный Inc, Micanopy, FL | Custom собраны (352) 284-2531 | |
| 384 микропланшетов | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Дышащие уплотнительная лента | Nunc | 241205 | |
| (5-гидрокси-р-naphthoqinone) юглон | ACROS | 121640010 | Юглон растворяется в ДМСО |
| ДМСО | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. Элеганс трансгенных напряжение | Автор лаборатории | VP596 | Pgst-4:: GFP и PDOP-3:: RFP |
Ссылки
- Simeonov, A. Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade. PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we.....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
