Высокопроизводительный скрининг и биодатчиков с люминесцентными С. Элеганс Штаммы

Summary

Процедура жидкой основе культивирования и отпуск С. Элеганс Штаммов выражения флуоресцентных белков репортер рассказал, что не требует дорогостоящего оборудования сортировки. Этот подход может быть применен к многочисленным индуцибельной С. Элеганс Генов для обнаружения наркотиков или биодатчиков загрязняющих веществ.

Abstract

Высокопроизводительный скрининг (HTS) - это мощный подход к идентификации химических модуляторов биологических процессов. Тем не менее, многие соединения, идентифицированные в скрининге с использованием моделей клеточных культур, часто оказываются токсичными или фармакологически неактивными in vivo^1-2. Скрининг на цельных животных моделях может помочь избежать этих ловушек и упростить процесс разработки лекарств.

C. elegans - это многоклеточный модельный организм, хорошо подходящий для HTS. Он имеет небольшие размеры (<1 мм) и может быть экономично культивирован и дозирован в жидкостях. C. elegans также является одной из наиболее экспериментально поддающихся лечению животных моделей, позволяющей быстро и подробно идентифицировать механизм действия препарата.

Мы описываем протокол культивирования и распределения флуоресцентных штаммов C. elegans для высокопроизводительного скрининга химических библиотек или обнаружения загрязнителей окружающей среды, которые изменяют экспрессию определенного гена. Большое количество синхронизированных по развитию червей выращивают в жидкой культуре, собирают, промывают и суспензируют при определенной плотности. Затем червей добавляют в черные 384-луночные планшеты с плоским дном с помощью перистальтического дозатора жидкости. Небольшие молекулы из химической библиотеки или тестовых образцов (например, воды, пищи или почвы) могут быть добавлены в колодцы с червями. In vivo интенсивность флуоресценции в реальном времени измеряется с помощью флуоресцентного микропланшетного ридера. Этот метод может быть адаптирован к любому индуцируемому гену у C. elegans, для которого имеется подходящий репортер. Многие индуцируемые стрессовые и транскрипционные пути развития хорошо определены у C. elegans, и для многих из них уже существуют трансгенные репортерные штаммы GFP⁴. В сочетании с соответствующими трансгенными репортерами наш метод может быть использован для скрининга модуляторов путей или для разработки надежных биосенсорных анализов на наличие загрязнителей окружающей среды.

Мы демонстрируем наш протокол культивирования и дозирования C. elegans с помощью анализа HTS, который мы разработали для мониторинга фактора транскрипции C. elegans cap 'n' collar SKN-1. СКН-1 и его гомолог Nrf2 у млекопитающих активируют цитопротекторные гены при окислительном и ксенобиотическом стрессе^5-10. Nrf2 защищает млекопитающих от многочисленных возрастных заболеваний, таких как рак, нейродегенерация и хроническое воспаление, и стал основной химиотерапевтической мишенью^11-13. Наш анализ основан на трансгенном репортере GFP для целевого гена SKN-1 gst-4 ¹⁴, который кодирует глутатион-s трансферазу⁶. Репортер GST-4 также является биосенсором для ксенобиотиков и окислительных химических веществ, которые активируют SKN-1 и могут использоваться для обнаружения низких уровней загрязняющих веществ, таких как акриламид и метилртуть^15-16.

Protocol

1. Подготовка бактериальных пищевых червь

День 1

1. Добавьте 5 мл насыщенного Е. OP50 кишечной бактериальной культуры до 500 мл бульона Потрясающе дополнена с 50 мкг / мл стрептомицина и расти в инкубатор встряхивания (225 оборотов в минуту) в течение ночи при температуре 37 ° C.

День 2

2. Сплит ночь бактериальной культуры в десятку 50 мл пробирки центрифуги и бактерий в охлажденном центрифуге при 2500 RCF течение 20 минут.
3. Декантировать от LB бульоне и ресуспендируют каждую бактериальную гранул в 10 мл жидкой питательной среды нематоды (НГО). Встряхните горизонтально полу шейкере в течение 15 минут для ресуспендирования бактерий. Для того, чтобы NGM буфера, добавляют 3 г NaCl на 1 л деионизированной воды и автоклав. Остудить до 55 ° С и добавить для того, следующие стерильные растворы: 1 мл 1 М CaCl _2, 1 мл 1 М MgSO ₄ и 25 мл 1 М фосфат калия, рН 6,0.
4. Центрифуга бактериальные культуры в охлажденном центрифуге при 2500 RCF течение 20 минут.
5. Декантировать с буфером NGM и весят бактериальных гранул.
6. Добавить равный объем NGM буфера для ресуспендирования гранулы, аликвоту 3 мл бактерий концентрата в 15 мл пробирки, и хранить при температуре -20 ° C.

2. Крупномасштабные C. Элеганс культуральной жидкости

Мы используем трансгенные линии VP596 (dvIs19 [pAF15 (GST-4:: GFP:: NLS)]; vsIs33 [доп-3:: RFP]) с двумя люминесцентными конструкций: Pgst -4:: GFP ¹⁴ для контроля СКН-1 деятельности и PDOP-3:: RFP ¹⁷ в качестве стандарта для червя нормализации числа.

День 1

1. Смешайте 150 мл NGM буфера, 1,5 мл LB бульоне, 150 мкл 5 мг / мл холестерина (в этаноле) и 75 мкл 100 мг / мл стрептомицина. Фильтр-стерилизации смеси и добавить в 1 л стерильной колбе.
   Примечание: добавление 1% LB бульоне в буфер NGM помогает предотвратить червей от прилипания к стеклянной посуды и Пластик, но этой суммы недостаточно, чтобы поддерживать рост бактерий.
2. Синхронизация с червями стандартная процедура гипохлорита ^18. До 0,5 мл беременных черви могут быть обработаны в одной трубке 15 мл с 5 мл раствора гипохлорита (3,75 мл дистиллированной воды, 1 мл отбеливателя, и 250 мкл 10 N NaOH). Мойте яйца выпущен стерильной водой и ресуспендируйте их в 10 мл буфера NGM.
3. Разбавьте образец яйца 100 раз в NGM буфер (например, 100 мкл в 10 мл) и подсчитать количество яиц в трех отдельных 5 мкл аликвоты. Несколько среднем число на 200 000 (100 коэффициент разбавления х 2000) для оценки общего количества яиц.
4. Добавить 200 000 до 2 млн. штук яиц в колбу с буфером NGM и встряхните культуры на 100 оборотов в минуту при 20 ° C.

День 2

5. По крайней мере 16 часов после добавления яйца в колбу, используйте стерильные серологические пипетки, чтобы удалить около 0,5 мл приостановлено червь культуры. Внесите три 5 мкл капель на стерильную крышку чашки Петри. Место крышкой в ​​морозильной камере -20 ° С в течение 1-2 минут, чтобы парализовать червей. Граф среднее число живых червей вылупились в 5 мкл, а затем несколько по 30000 (150 мл / 5 мкл), чтобы оценить общее количество вылупившихся червей.
6. Оттепель трубки замороженных OP50 бактериальной культуры (протокол 1.6) и добавить 3 мл 50% OP50 на червя культуры в 500000 вылупились червей. Встряхните колбу на 100 оборотов в минуту при 20 ° C. Черви будут развиваться в L4 личинок и молодых людей в около 51 часов. OD600 бактерий должно быть около 2,200 в начале. Монитор количество бактерий по поглощению и добавить больше, если OD 600 опускается ниже 0,900.

3. Сбор червей и дозирования

День 4

1. Используйте стерильные серологические пипетки для передачи около 0,5 мл приостановлено червь культуры стандартные пластины агара NGM. Посмотреть черви с стереомикроскопа, чтобы убедиться, что большинство из них L4 личинок или молодых взрослых. L4 личинки будут иметь вентральной ясно пятно в середине тела. Молодые люди будут немного больше, и не будет иметь четкое пятно.
2. Налейте червь культуры в стерильные 50 мл пробирок и места труб в стойке пробирку на настольный. Разрешить червей урегулировать в течение приблизительно 10 минут. Удалить супернатант аспирацией или пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть важно, чтобы удалить невылупившиеся яйца или червей, которые не развивались, потому что они решат медленнее, чем L4 личинок и молодых взрослых.
3. Соберите все черви в единый 50 мл трубки и промыть NGM буфере с 1% LB бульоне (НГО + LB) 3-4 раз, чтобы удалить бактерии.
   Примечание: Это лучше всего делать в ведре размахивая-центрифуга, собирая червей при 500 RCF в течение 30 сек и замены супернатант со свежими NGM + LB буфера.
4. После мытья, заполнить трубу с NGM + LB буфера до 50 мл и вылить в пользовательских червь дозирования колбу. Добавьте небольшое мешалкой и движение, чтобы сохранить червей приостановлено. Граф-йэлектронной количество червей в трех 5 мкл капли, как указано выше. Разбавить LB NGM + пока вы не получите 12-15 червей на 5 мкл каплю (~ 2,5-3,0 черви / мкл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: минимум около 20 мл (60000 червей) необходимо, чтобы заполнить пустое пространство из отпуска колбу и диспенсер кассету. Каждый 384-луночного планшета требуется около 35 тысяч червей, или 11,5 мл приостановлено червей.
5. Нагрузка 10 мкл дозирования кассету и стерилизовать грунтовки с 70% этанола. Полоскание этанола грунтовки стерильной водой.
6. Вставьте конец отпуска кассету в колбу так, чтобы она чуть выше мешалкой, не нарушая его движения. Убедитесь, что черви остаются взвешенными в течение всего колбу. Программа диспенсер обойтись на низкой скорости с 2 предварительно импульсов. Премьер и запустить не менее 10 мл взвешенных червей. Заполните пластин при необходимости быстро, чтобы предотвратить червей поселиться в трубку.
7. Уплотнение пластин с дышащей ленты.
8. Место пластин на встряхивая платформы в инкубаторе при соответствующей температуре для вашего анализа. Не ставьте пластин.

4. Люминесцентный анализ

1. Место визирной в микропланшет-ридера для измерения интенсивности флуоресценции каждой скважины с соответствующей длиной волны излучения и возбуждения (фильтры для нашего анализа: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em).
2. Рассчитать отношение GFP / ППП и нормализации с показаниями контроля скважин (без активации соединения) для определения точного кратную разницу в интенсивности флуоресценции производных от индивидуального лечения.

5. Представитель Результаты:

Наши SKN-1 использует анализ хромосомно встроенных контроллера напряжение репортера (VP596). Как показано на рисунке 1, количество червей хорошо коррелирует с объемом обойтись. Как показано на рисунках 2А и 2В, общая GFP и RFP флуоресценции на лунку очень воспроизводимые от скважины к скважине через 384 луночный планшет. Как показано на рис 2С, не-индуцированной Pgst-4:: GFP флуоресценции линейно коррелирует с PDOP-3:: ЗП по 384 скважин. При выраженной как отношение GFP / ППП, флуоресценция становится очень воспроизводимые от скважины к скважине через 384-луночного планшета (сравнить коэффициент вариации из рисунка 2D до 2) демонстрация способности PDOP-3:: RFP репортер уменьшить изменчивость. Как показано на рисунке 3, индукция относительной GFP для ППП с СКН-1 активации ксенобиотиков (38 мкМ юглон), является перспективным и очень воспроизводимые через 384 луночный планшет.

Рисунок 1. Количество червей в сравнении с объемом обойтись. Черви разбавляли до примерно 2/μl и разливали в 24-луночный планшет для ручного подсчета с стереомикроскопа. N = 8 скважин в объеме.

Рисунок 2. Всего флуоресценции червей обойтись в 384-луночного планшета является воспроизводимым. Черви разбавляли до примерно 2.5/μl и 30 мкл был разлит в каждую лунку 384 луночный планшет. GFP () и ППП (В) флуоресценции всех скважин, коэффициент вариации ниже 9%. (C) GFP флуоресценции тесно связана с ППП флуоресценции. (D) Расчет соотношения GFP для ППП снижается коэффициент вариации ниже 6% (A, B и D) Сплошные линии указывают средства и ломаные линии указывают на три стандартных отклонения выше или ниже среднего.

. Рисунок 3 Активация Pgst-4:: GFP является надежным и последовательным. Примерно 75 L4 черви были распределены во все лунки по 384-луночного планшета и 38 мкМ юглон был добавлен в любой другой колонке. GFP и RFP флуоресценции измеряли после 21 ч инкубации. Средняя относительная флуоресценция отношения всех контрольных (1,0) и юглон скважин (8,9) обозначены сплошными линиями. Три стандартных отклонения выше среднего и контроль ниже юглон означает обозначены пунктирными линиями.

Discussion

Мы представляем метод выращивания и приготовления большого количества трансгенных нематод. Оборудования, используемых для культивирования червей является стандартным для лабораторий, осуществляющих молекулярное клонирование и наливных и флуоресценции оборудования является стандартной для лабораторий обработку большого количества микропланшетов. Другие методы выдачи большого количества живых C. Элеганс требуют дорогостоящего частиц сортировочного оборудования ^19. Pgst-4:: GFP анализа могут бы...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
LB бульоне	Исследования Продукты интернэшнл корп	L24066
Потрясающе бульон	Исследования Продукты интернэшнл корп	T15100
Synergy ™ HT Multi-режим Считыватель микропланшетов	Биотек		Фильтры: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em
MicroFlo Выберите диспенсер	Биотек
Worm дозирования колбу	Южный научный Inc, Micanopy, FL		Custom собраны (352) 284-2531
384 микропланшетов	Greiner Bio-One	5678-1209
Дышащие уплотнительная лента	Nunc	241205
(5-гидрокси-р-naphthoqinone) юглон	ACROS	121640010	Юглон растворяется в ДМСО
ДМСО	Sigma-Aldrich	D-5879
C. Элеганс трансгенных напряжение	Автор лаборатории	VP596	Pgst-4:: GFP и PDOP-3:: RFP