Малоинвазивных протокол для стабилизации позвоночника мыши и выполнять повторяющиеся В естественных условиях Спинного изображений шнур с помощью двух-фотонной микроскопии описаны. Этот метод сочетает в себе спинного устройств стабилизации и обезболивающий режим для минимизации дыхательных вызванных движениями и производить необработанные данные изображения, которые не требуют выравнивания или других пост-обработки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В естественных условиях Визуализация Мышь спинного мозга с использованием двух-фотонной микроскопии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В естественных изображений с помощью двух-фотонной микроскопии 1 у мышей, которые были генетически выразить флуоресцентных белков в определенных типах клеток 2-3 значительно расширили наши знания о физиологических и патологических процессов в различных тканях в естественных условиях 4-7. В исследованиях центральной нервной системы (ЦНС), наблюдается широкое применение в естественных изображений в мозге, который выпустил множество новых и часто неожиданные выводы о поведении клеток, таких как нейроны, астроциты, микроглия, под физиологических или патологических состояний 8-17. Тем не менее, в основном технические сложности имеют ограниченные реализации в области обработки изображений естественных условиях в исследованиях живой мыши спинного мозга. В частности, анатомическая близость спинного мозга в легкие и сердце генерирует значительные артефакты движения, что делает изображение живым спинного мозга сложной задачей. Мы разработали новый метод, который позволяет преодолеть ограничения, присущие спинного изображений шнура путем стабилизации позвоночника, уменьшения дыхательных вызванных движениями и тем самым облегчая использование двух-фотонной микроскопии для изображения мыши спинного мозга в естественных условиях. Это достигается путем объединения индивидуальных спинного устройство стабилизации с методом глубокого наркоза, что привело к значительному сокращению дыхательных вызванных движениями. Это видео протоколе показано, как предоставить небольшой участок живой спинного мозга, которые могут быть сохранены в стабильных физиологических условиях в течение длительного периода времени, сохраняя повреждения тканей и кровотечение к минимуму. Представитель сырых изображений, полученных в естественных деталей в высоком разрешении тесную связь между микроглии и сосудов. Timelapse последовательность показывает динамическое поведение микроглии процессов в живой мыши спинного мозга. Кроме того, непрерывное сканирование одного и того же г-кадр продемонстрироватьс выдающейся стабильности, что этот метод может достичь для получения стеков изображений и / или timelapse фильмы, которые не требуют выравнивания изображения после приобретения. Наконец, мы покажем, как этот метод может быть использован для пересмотра и Reimage же участок спинного мозга на более поздних timepoints, что позволяет для продольного исследования текущих физиологических или патологических процессов в живом организме.
Протокол
1. Строительство спинного устройство стабилизации
- Заказ Narishige STS-Компактный спинного мозга и зажимы Narishige MA-6N голову холдинга адаптера.
- Custom спроектировать и изготовить из нержавеющей стали плите провести два Narishige частей в соответствие так, что голова животного поддерживается в то время как позвоночник и хвост зажат. Имейте в виду, что все устройства должны помещаться под микроскопом линзы обычно на снизил столик микроскопа.
2. Животное хирургии
- Разогреть микроскоп камеры с устройством подогрева воздуха и поддерживать его при температуре 37 ° C.
- Взвешивание животных и сдела....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Метод, описанный здесь сохраняется стабильная и повторяющихся в естественных изображений густонаселенных флуоресцентные клеточных структур в спинной мозг мышей под наркозом с помощью двух-фотонной микроскопии. Достигнутая стабильность является результатом заказ спинного устройств стабилизации и режим анестезии, которая уменьшает дыхательную вызванной движением артефакт. Спинного устройство стабилизации позволяет передышку под корпусе мыши и могут быть построены с использованием коммерчески доступных спинного за.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нам нечего раскрывать.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Национального общества рассеянного склероза грант RG4595A1 / T с РД и NIH / NINDS гранты NS051470, NS052189 и NS066361 К. А. Рисунки и фильмы адаптированы и / или перепечатана из Давалос и соавт., J Neurosci методы. 30 марта 2008; 169 (1) :1-7 Copyright 2008, с разрешения Elsevier.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | Комментарии |
| Родамина Б декстрана | Invitrogen | D1841 | 70 кДа, разбавленных в ACSF (3% вес / объем) |
| Кетамин HCl | Bionichepharma | НДЦ No: 67457-001-10 | Инъекций, 50мг/мл |
| Anased | Ллойд Labs | NADA No: 139-236 | Ксилазин инъекций, 20mg/ml |
| Acepromazine | Vedco | NADA No: 117-531 | Инъекций, 10mg/ml |
| Искусственные слезы мазь | Феникс фармацевтический | НДЦ No: 57319-760 - 25 | Смазка |
| Бетадин | Рыболов | 19-061617 | |
| Макферсон-Уэсткотт Ножницы | Всемирный Precision Инструменты | 555500S | Изогнутые, тупым наконечником ножницы |
| Прямой пинцет | Всемирный Precision Инструменты | 555047FT | Зубчатые пинцетом кончик |
| Малый сосуд прижечь | Инструменты изобразительных наук | 18000-00 | |
| Gelfoam | Pharmacia, Pfizer Inc | Вибрационная мельница MM400 | |
| Компактный спинного мозга Зажимы | Narishige | STS- | |
| Глава холдинга адаптер | Narishige | MA-6N | |
| Gelseal | Amersham Корпорация Biosciences | 80-6421-43 | |
| Лактата Рингера | Baxter Healthcare | 2B8609 | |
| Buprenex | Reckit Benckiser Фармацевтическая продукция Inc | НДЦ №: 12496 - 6757-1 | Бупренорфин, инъецируемый |
| Baytril | Bayer | NADA 140-913 | Энрофлоксацин, антибактериальные инъекционные 2,27% (20 мл) |
| Отопление площадке - Большой | Инструменты изобразительных наук | 21060-10 |
Ссылки
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Feng, G.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
